于明航 ，李 楊 ，閻 晗 ，王 瑾 ，黃 珊 ，袁順宗 ，尹 潔 ，李澤興 ，王 璽

（1.天津醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，天津300070；2.中國(guó)人民解放軍307醫(yī)院頭頸腫瘤科,北京100853）

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK cells）是機(jī)體進(jìn)行免疫防疫的第一道防線，主要是抵抗細(xì)菌、真菌、病毒以及病原微生物的入侵[1-3]，同時(shí)NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫方面也扮演著重要的角色[4-6]。但是NK細(xì)胞在發(fā)育和功能等方面還有許多的未知機(jī)制。利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究NK的發(fā)育與功能是一個(gè)

非常有效的工具。NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是對(duì)表達(dá)NKp46受體的NK細(xì)胞進(jìn)行特異性敲除的工具鼠[7-8]。在本次研究中，主要是利用ROSA26R-YFP小鼠與NKp46-Cre小鼠雜交，通過(guò)對(duì)小鼠體內(nèi)細(xì)胞YFP的表達(dá)驗(yàn)證NKp46-Cre的敲除效率以及是否具有特異性，目的是構(gòu)建YFP基因報(bào)告系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究NK細(xì)胞的功能與發(fā)育做好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ROSA26R-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠（哈佛醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)），NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（中國(guó)解放軍307醫(yī)院袁順宗老師惠贈(zèng)）；鼠尾堿性裂解液（25 mmol/L NaOH；EDTA．Na20．2 mol/L），鼠尾酸性中和液（Tris-HCl 40 mmol/L，pH=5）Tag DNA 聚合酶（康成）；普通PCR 儀（ABI）；流式細(xì)胞儀（BD）；Percific Blue-CD3e（BD），APC-CD19（BD）；PE-NKp46（BD）；引物由北京奧科合成，引物序列見表1。

表1PCR引物Tab 1 PCR primers

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠與NKp46-Cre（+/-）小鼠雜交，子代在出生25 d左右進(jìn)行耳標(biāo)編號(hào)，并剪鼠尾進(jìn)行基因型鑒定。將鼠尾浸泡含有75 μL的堿性裂解液的離心管中，將離心管置于100℃金屬水浴鍋30 min；冰上裂解5 min；5 min后向樣品中加入75 μL的酸性中和液并將鼠尾吹打均勻，Nanodrop 2000測(cè)濃度；按照Tag DNA聚合酶試劑盒進(jìn)行配制PCR體系；95℃10 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，結(jié)束后在凝膠成像儀中記錄結(jié)果。

1．2．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各個(gè)組織器官YFP的表達(dá) 頸椎脫臼法處死ROSA26R-YFP（+/+）NKp46-Cre（+/-）和 ROSA26R-YFP（-/-）NKp46-Cre（-/-）的小鼠，分別取兩種小鼠的脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和心臟，將組織在1640培養(yǎng)基中研磨，用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單個(gè)懸浮細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，選取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式上機(jī)，最后用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中各個(gè)免疫細(xì)胞的YFP的陽(yáng)性效率 按1．2．2的方法提取脾臟的淋巴細(xì)胞；將YFP雙陽(yáng)性的帶有NKp46-Cre的小鼠淋巴細(xì)胞每1×106個(gè)細(xì)胞制成單個(gè)懸浮細(xì)胞于3個(gè)管，分別標(biāo)記 CD3、CD19、NKp46；分別加入1μL 抗體標(biāo)記的 Percific Blue-CD3e，APC-CD19，PE-NKp46，并且每管都加入1 μL NKp46的抗體，室溫避光30 min；300g，5min離心收集細(xì)胞，最后用 300μL 的PBS重懸，另外需要一個(gè)含有2×106個(gè)細(xì)胞Negative管，500 μL PBS重懸，最后將樣品轉(zhuǎn)入流式管，準(zhǔn)備流式上機(jī)，最后用 FlowJo（7．6）軟件進(jìn)行分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間樣品均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠與NKp46-Cre（+/-）小鼠雜交后代共有14只小鼠，提取基因組DNA并進(jìn)行基因型鑒定。已知YFP野生型的PCR條帶為600 bp（YFP-），而YPF陽(yáng)性的PCR條帶為320 bp（YFP+），Cre野生型的PCR條帶為454bp（Cre-），而YPF陽(yáng)性的PCR條帶為282bp（Cre+），基因型結(jié)果鑒定見圖1、表2。根據(jù)表格選擇對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

圖1ROSA2R-YFP(+/-)與NKp46-Cre（+/-）雜交小鼠后代基因型鑒定結(jié)果Fig 1 The YFP genotyping results of the hybrid mice ROSA26RYFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

表2ROSA2R-YFP(+/-)與NKp46-Cre（+/-）雜交小鼠后代基因型鑒定結(jié)果Tab 2 ThegenotypingresultsofthehybridmiceROSA26R-YFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

2.2 各個(gè)組織器官中YFP陽(yáng)性的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)根據(jù)基因型鑒定結(jié)果分成的實(shí)驗(yàn)組ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）和對(duì)照組ROSA26R-YFP(-/-)NKp46-Cre（-/-）小鼠的免疫器官（脾臟、淋巴結(jié)、骨髓）和非免疫器官（心臟）中細(xì)胞YFP陽(yáng)性的表達(dá)，見圖2。雙陽(yáng)性小鼠淋巴結(jié)、骨髓、脾臟中YFP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比分別為0.589%±1.02%、1.89%±1.28%、4.53%±1.54%；陰性對(duì)照 YFP（-/-）Cre（-/-）小鼠相對(duì)應(yīng)的器官 YFP 陽(yáng)性百分比分別為0.008%±0.003%、0.126%±0.08%、0.12%±0.004%；與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組小鼠的心臟細(xì)胞中基本沒(méi)有YFP的表達(dá)，其中YFP的表達(dá)百分比分別為 0.009%±0.0002%、0.03%±0.012%，兩組之間沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NKp46-Cre介導(dǎo)的YFP的表達(dá)在免疫器官中具有特異性。

圖2 免疫器官（淋巴結(jié)、骨髓、脾臟）和非免疫器官（心臟）的YFP表達(dá)情況Fig 2 The expression levels of YFP in immune organs and non-immune organs

2.3 脾臟淋巴細(xì)胞系中YFP陽(yáng)性的表達(dá)效率 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）小鼠脾臟中淋巴細(xì)胞系（T cells、B Cells、NK cells）的YFP標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。ROSA26R-YFP陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞的百分比，分別為89.4%±1.08%、0.89%±0.56%、0.82%±0.82%，在各種細(xì)胞中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NKp46-Cre系統(tǒng)介導(dǎo)的YFP熒光報(bào)告系統(tǒng)可以準(zhǔn)確代表小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞（圖3）。

圖3 免疫器官脾臟淋巴細(xì)胞系中YFP的表達(dá)情況Fig 3 The percentages of YFP in spleen lymphocyte lineage of immune organ

3 討論

自然殺傷細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細(xì)胞，它主要分布于次級(jí)淋巴組織器官以及外周血中[9-11]，NK細(xì)胞不像T細(xì)胞，它不需要預(yù)先致敏就能發(fā)揮殺傷作用或分泌細(xì)胞因子、趨化因子等能力[12-14]。截止到目前為止，對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育分化以及功能方面的調(diào)控仍然存在很多的未知，而現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，對(duì)于NK細(xì)胞的進(jìn)一步研究提供了非常有效的工具。

NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是一種專門介導(dǎo)表達(dá)NKp46受體的NK細(xì)胞的敲除小鼠[7]?，F(xiàn)階段，Cre重組酶介導(dǎo)的基因敲除檢測(cè)主要集中在基因組的基因型鑒定，RT-PCR以及Western等技術(shù)在DNA、mRNA和蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證，而這些實(shí)驗(yàn)對(duì)于做免疫功能實(shí)驗(yàn)較為困難，并且不利于活體實(shí)驗(yàn)的研究。因此，在本次實(shí)驗(yàn)中引入了ROSA26R-YFP熒光報(bào)告基因小鼠與NKp46-Cre小鼠雜交，借助Cre重組酶系統(tǒng)切除ROSA26R-YFP熒光報(bào)告基因前面的終止子從而表達(dá)YFP蛋白[15]，形成觀察NK細(xì)胞的一種有效手段。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們得到了ROSA26R-YFP（+/-）或ROSA26R-YFP（+/+）的NK細(xì)胞，并且在各個(gè)免疫器官（脾臟、淋巴結(jié)、骨髓）中得到Y(jié)FP的陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)了YFP陽(yáng)性NK細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率在80%以上，而在ROSA26R-YFP（+/+）純合的小鼠中的陽(yáng)性率更高達(dá)90%左右。雖然YFP標(biāo)記NK細(xì)胞并不是100%，可能還是與Cre重組酶的敲除效率有關(guān)，但其結(jié)果證實(shí)YFP陽(yáng)性細(xì)胞可代表NK細(xì)胞，為了以后進(jìn)一步的研究我們會(huì)采取ROSA26R-YFP（+/+）純合的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明YFP基因報(bào)告系統(tǒng)可行，在以后的實(shí)驗(yàn)中可以選擇YFP陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有利于分析NK細(xì)胞的分化和增殖，而對(duì)于功能方面利用YFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，也有著重要的作用，因此，這個(gè)系統(tǒng)的建立可以更加深入地探討NK細(xì)胞地發(fā)育和功能方面的問(wèn)題，為免疫細(xì)胞的研究提供了方向。

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