張?zhí)N穎，齊曉怡，王傲雪，唐田，涂彩霞

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連116027）

特應(yīng)性皮炎是皮膚科臨床中常見、反復(fù)發(fā)作的一種疾病。特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率較高[1-2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。瘙癢是其常見癥狀之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。最近研究顯示白細(xì)胞介素（IL）-31在特應(yīng)性皮炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，與瘙癢相關(guān)[1-2]。本研究通過檢測(cè)中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IL-31及IgE的水平，并分析其與臨床評(píng)分的相關(guān)性，為判斷病情提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科門診中重度特應(yīng)性皮炎患者18例，其中男9例，女 6例；患者年齡 16～48 歲，平均（27.11±9.80）歲；特應(yīng)性皮炎病程4周～43年；根據(jù)中國特應(yīng)性皮炎診療指南（2014版），應(yīng)用SCORing Atopic Dermatitis（SCORAD）評(píng)分判定患者病情嚴(yán)重程度，計(jì)算公式為（A/5+7B/2+C）。其中A為皮損面積：成人的頭頸部、上肢各9%，軀干前、后各13.5%，下肢各22.5%；14歲以下兒童頭頸部、上肢各9%，軀干前、后和下肢各18%；2歲以下兒童頭頸部為17%，上肢各9%，軀干前、后各18%，下肢各12%；以1%的面積為1分。B為皮損嚴(yán)重程度，包括6項(xiàng)體征：紅斑、丘疹（或）水腫、滲出（或）結(jié)痂、表皮剝脫、苔蘚化、皮膚干燥（評(píng)價(jià)未受累皮膚）。根據(jù)皮損輕重程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0～3 4級(jí)評(píng)分法；C為瘙癢和影響睡眠程度：按最近3晝夜平均來分，每項(xiàng)各評(píng)分為0～10分（視覺模擬尺）?？偡址秶鸀?～103分。在臨床使用中，根據(jù)總分來確定疾病的嚴(yán)重程度，0～24分為輕度，25～50分為中度，51～103分為重度。根據(jù)SCORAD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，得分大于25的患者入組。入組者 SCORAD 評(píng)分為 53.1～84.2，平均（69.04±9.86）。選取25例健康志愿者作為對(duì)照，年齡為18～50歲，平均（31.88±10.53）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：中重度特應(yīng)性皮炎患者（SCORAD評(píng)分＞25分）；近2個(gè)月未使用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物、免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有免疫相關(guān)性疾病如白癜風(fēng)、銀屑病、自身免疫性甲狀腺疾病、Ⅰ型糖尿病、斑禿、慢性蕁麻疹等患者；嚴(yán)重肝腎等系統(tǒng)性疾病患者；孕婦及哺乳期婦女。

1.2 試劑和儀器 APC標(biāo)記的抗人CD3（Becton Dickinson，美國），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗人 CD4（Becton Dickinson，美國），PE 標(biāo)記的抗人 CD69（Becton Dickinson，美國），同型對(duì)照抗體PE標(biāo)記的鼠IgG1（Becton Dickinson，美國），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國），人 IL-31試劑盒（Elabscience，中國），人免疫球蛋白E ELISA試劑盒（Elabscience，中國），酶標(biāo)儀（Molecular Devices Corporation，美國）。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 抽取患者及健康對(duì)照者外周靜脈血2 mL于肝素抗凝管中，加入2 mL PBS重懸后2 000轉(zhuǎn)/min，常溫離心5min后棄上清，重復(fù)洗3遍，400 μL PBS重懸。每個(gè)試管中各加入50 μL混懸液，分別依次加入8 μL APC標(biāo)記的抗人CD3、8μL FITC 標(biāo)記的抗人 CD4、8μL PE 標(biāo)記的抗人CD69、8μL同型對(duì)照抗體PE標(biāo)記的鼠IgG1，混勻避光孵育15 min。加入溶血素0.5 mL，混勻，避光孵育10 min，2 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清。2 mL PBS重懸，2 000轉(zhuǎn)/min離心 5min，棄上清。300 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 ELISA檢測(cè) 采用雙抗體夾心分別測(cè)定血清中IL-31、IgE的水平，按試劑盒說明書同一批次完成。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及相應(yīng)軟件計(jì)算出IL-31、IgE的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Person檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血CD4+T細(xì)胞的活化 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血CD3+CD4+CD69+T細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（4.80±2.05）%，正常人外周血CD3+CD4+CD69+T細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（1.36±0.92）%，2 組間比較，t=7.44，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 健康人及AD患者外周血CD3+CD4+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)

2.2 中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IL-31的檢測(cè)及與臨床相關(guān)性 中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IL-31水平為（111.51±25.79）pg/mL，正常人為（64.20±8.86）pg/mL，2 組間比較，t=8.534，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IL-31水平與SCORAD評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，t=0.506，P＜0.05，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IgE的檢測(cè)及與臨床相關(guān)性 中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IgE水平（514.72±205.27）IU/mL，正常人為（49.32±33.96）IU/mL，2 組間比較，t=11.18，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中重度特應(yīng)性皮炎患者外周血IgE水平與SCORAD評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，t=0.567，P＜0.05，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

IL-31是2004年被發(fā)現(xiàn)的，屬于IL-6細(xì)胞因子家族成員，主要由活化的T細(xì)胞特別是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生。IL-31成熟分子主要包括141個(gè)氨基酸，其空間結(jié)構(gòu)包含4個(gè)螺旋束。2004年，通過轉(zhuǎn)基因鼠慢性皮炎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)IL-31與嚴(yán)重瘙癢相關(guān)，并且特異性淋巴結(jié)過度表達(dá)IL-31[3]。在轉(zhuǎn)基因鼠中特異性淋巴結(jié)IL-31表達(dá)升高，其可誘導(dǎo)嚴(yán)重的瘙癢，并與慢性皮炎的加重相關(guān)[3]。在Nc/Nga小鼠中有搔抓行為的小鼠比沒有搔抓行為的小鼠皮膚IL-31mRNA水平明顯升高[4]。與正常人相比，瘙癢明顯的AD患者皮膚中IL-31mRNA明顯升高[1]。目前研究證實(shí)IL-31在特應(yīng)性皮炎中發(fā)揮作用，特應(yīng)性皮炎中血清表達(dá)水平升高，且臨床SCORAD評(píng)分與IL-31水平呈正相關(guān)[5]。與此相似，有研究顯示55例特應(yīng)性皮炎患者外周血中IL-31水平明顯升高，且與血清總IgE水平及瘙癢程度相關(guān)[6]。本研究顯示18例中重度異位性皮炎患者外周血IL-31、IgE水平明顯升高，與既往研究結(jié)果一致，同時(shí)均與SCORAD評(píng)分具有相關(guān)性，臨床中其表達(dá)水平可作為監(jiān)測(cè)特應(yīng)性皮炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

在皮膚T淋巴細(xì)胞瘤中，抽取自覺瘙癢的患者外周血，提取CD4+T細(xì)胞并刺激培養(yǎng)后，IL-31的水平明顯升高。CD69為活化誘導(dǎo)分子，為T淋巴細(xì)胞激活后最早表達(dá)的表面抗原，是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的一部分，其表達(dá)后可上調(diào)某些細(xì)胞因子及其受體的合成與表達(dá)，可促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化、增殖，在某些疾病中作為活動(dòng)期監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Szegedi等[7]研究發(fā)現(xiàn)在特應(yīng)性皮炎中產(chǎn)生IL-31的T細(xì)胞明顯增加，且患者外周血中IL-31的水平與產(chǎn)生IL-31的CD4＋T細(xì)胞數(shù)量及疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。在本研究中，筆者應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示中重度特應(yīng)性皮炎中CD4＋CD69+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示特應(yīng)性皮炎患者體內(nèi)T細(xì)胞被信號(hào)分子激活活化，從而可能促進(jìn)細(xì)胞因子的進(jìn)一步分泌，加重臨床癥狀，但其具體調(diào)控機(jī)制尚須進(jìn)一步研究探討。

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