陳良，蔣錦琪，馮輝

硝酸酯類藥物是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的經(jīng)典用藥，并在多種心血管疾病的急救和常規(guī)治療中發(fā)揮舉足輕重的作用。然而，持續(xù)用藥24～72 h以上或短間隙頻繁用藥則很容易產(chǎn)生硝酸酯耐藥，影響長期藥效。為此，各種動物模型或臨床試驗探索硝酸酯耐藥的機制和防治方法，國外研究顯示鳥苷酸環(huán)化酶激活物BAY 60-2770及松弛素可以通過增加血管一氧化氮（NO）水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)來改善硝酸酯耐藥[1,2]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作為一種巰基供給體，可通過抗氧化發(fā)揮心臟、腎臟、呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。NAC的心臟保護作用主要表現(xiàn)在心肌缺血/再灌注方面，其在改善硝酸酯耐藥效應(yīng)方面鮮有報道。本研究采用5-單硝酸異山梨醇酯（ISMN）建立動脈粥樣硬化兔的硝酸酯耐藥模型，探討其耐藥機制并觀察口服巰基供體NAC對硝酸酯耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 單硝酸異山梨醇酯緩釋膠囊（H20031224，優(yōu)時比制藥有限公司），乙酰半胱氨酸顆粒（H20000472，海南贊邦制藥有限公司），鹽酸賽拉嗪注射液（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司），硝酸甘油注射液（H11020291，北京益民藥業(yè)有限公司）?？钩跫俺蹶庪x子自由基（·O2-）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、NO試劑盒、微量總巰基（T-SH）測試盒均購于南京建成生物工程研究所，內(nèi)皮素-1（ET-1）放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。Fogarty動脈取血栓導(dǎo)管（YZB/USA 4009-77-2004，美國愛德華生命科學(xué)世界貿(mào)易公司）。MPA 2000離體實驗系統(tǒng)、ALC-M恒溫組織浴槽由上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)。K-H溶液配方：NaCl 130 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.17 mmol/L、KH2PO4 1.18 mmol/L、NaHCO314.9 mmol/L、CaCl21.6 mmol/L、Glucose 5.5 mmol/L、EDTA 0.026 mmol/L。

1.2 實驗動物及分組 40只雄性新西蘭大白兔（上海杰思捷實驗動物有限公司提供），體質(zhì)量（2500 ±200）g。動物的飼養(yǎng)和實驗過程遵循國家《實驗動物管理條例》和《實驗動物質(zhì)量管理辦法》。并隨機分為正常組、模型組（AS組）、硝酸酯組（ISMN組）、硝酸酯耐藥組（NT組）和用藥組（NT+NAC組），各8只。模型組以及藥物干預(yù)組均建立腹主動脈粥樣硬化模型。

1.3 腹主動脈粥樣硬化模型建立[3]實驗兔麻醉

后，取仰臥位，右下肢備皮，常規(guī)消毒鋪巾，解剖暴露右膝隱動脈，縱向切開管壁，向近端插入3F Fogarty動脈取血栓導(dǎo)管約20～25 cm至腹主動脈上端，向球囊內(nèi)注入生理鹽水0.1～0.15 ml充盈球囊至適當(dāng)阻力，沿動脈來回牽拉球囊約5～8 cm，反復(fù)3次以保證充分剝脫損傷動脈內(nèi)皮，拔除導(dǎo)管，結(jié)扎隱動脈，縫合傷口。術(shù)畢每日肌注慶大霉素8萬單位共3 d，并飼以高脂飼料（0.5%膽固醇+5%豬油+15%蛋黃粉+79.5%普通飼料）共8周。通過病理組織學(xué)證實兔腹主動脈粥樣硬化模型建立情況。

1.4 給藥方案 高脂飼料飼養(yǎng)8周后，ISMN組灌胃給予ISMN 25 mg，1/24 h；NT組灌胃ISMN 25 mg，1/12 h；NT+NAC組則同時灌胃ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h；AS組和正常組（普通飼料）不用藥。給藥期間繼續(xù)高脂飲食。

1.5 取材與檢測 連續(xù)給藥7 d后，5組實驗兔均以相同方法取材和檢測。切取腹主動脈，浸于K-H溶液中，而后每5 mm剪為數(shù)段。取1段行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色并中性樹膠封片，于顯微鏡下判斷動脈粥樣硬化形成情況；另取1段用以血管環(huán)舒張反應(yīng)檢測；其余各段分別通過相應(yīng)試劑盒行血管組織T-SH（微量酶標(biāo)法）、·O2-（化學(xué)比色法）、SOD（黃嘌呤氧化酶法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、NO2-（亞硝酸鹽，硝酸還原酶法）、ET-1（雙抗體夾心ABC-ELISA法）測定，其操作嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.6 血管環(huán)舒張反應(yīng)檢測 將所取血管環(huán)一端與肌力傳感器相連，懸掛于裝有10 ml K-H溶液的ALC-M恒溫（37 ℃）組織浴槽中，另一端加以2 g負(fù)荷，連續(xù)通入含95%O2及5%CO2的混合氣體，平衡2 h，使血管平滑肌處于最穩(wěn)定長度。平衡后通過MPA 2000離體實驗系統(tǒng)記錄血管環(huán)靜息張力及收縮舒張曲線，然后加入10-5mol/L的苯腎上腺素，當(dāng)血管收縮至最大張力時記錄數(shù)值，曲線平坦穩(wěn)定后依次加入10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的硝酸甘油（NTG），輕拌攪勻，記錄相應(yīng)濃度梯度的張力值，計算舒張幅度百分比=（最大張力值-梯度張力值）/（最大張力值-靜息張力值）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 8.1軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔腹主動脈粥樣硬化建模結(jié)果 取材前所有實驗兔均狀態(tài)良好，無腹瀉、感染等并發(fā)癥。對動脈粥樣硬化實驗兔的腹主動脈進行肉眼觀察，血管內(nèi)膜均出現(xiàn)不規(guī)則隆起的灰黃色斑塊、斑點或長短不一的條紋。各建模組HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察均可見內(nèi)膜不同程度的增厚，大量泡沫細胞、平滑肌細胞和脂質(zhì)沉積。提示實驗兔的腹主動脈粥樣硬化模型均制備成功，圖1。

2.2 血管環(huán)舒張反應(yīng)結(jié)果 各組血管環(huán)的舒張幅度均隨NTG濃度的增加而遞增。當(dāng)NTG為10-9mol/L時，正常組、AS組、ISMN組及NT+NAC組之間血管舒張幅度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；NT組則顯著低于其余四組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。當(dāng)NTG濃度為10-8～10-4mol/L時，與正常組比較，AS組、ISMN組、NT組以及NT+NAC組血管舒張幅度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；NT組血管舒張幅度則顯著低于其余四組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。當(dāng)NTG濃度達到10-4mol/L時，正常組、AS組、ISMN組和NT+NAC組的最大舒張幅度分別為（98.91±1.99）%、（79.12±6.28）%、（81.17±7.75）%和（81.92±9.59）%，NT組僅為（58.87±8.09）%，表1。

2.3 各組生化指標(biāo)測定結(jié)果 T-SH含量由高至低依次為正常組、AS組、NT+NAC組、ISMN組及NT組，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）?！2-、MDA、ET-1和NO2-含量：正常組、AS組、NT+NAC組、ISMN組、NT組呈升高趨勢，除正常組與AS組外，其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。NT組SOD含量低于正常組，且NT+NAC組SOD含量高于NT組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），表2。

3 討論

硝酸酯藥物常用于治療冠狀動脈粥樣硬化心肌缺血、充血性心力衰竭、高血壓等心血管疾病，其主要機制是作為一種非內(nèi)皮依賴性外源性NO供體[4,5]。低濃度的NO與肌膜上可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）血紅素結(jié)構(gòu)域的Fe2+結(jié)合形成復(fù)合物，使sGC處于輕度激活狀態(tài)，而高濃度的NO可進一步與sGC非血紅素結(jié)合位點的半胱氨酸-SH結(jié)合而完全激活sGC[6,7]。激活的sGC可使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）生成增加，從而抑制細胞外Ca2+內(nèi)流、增加細胞內(nèi)Ca2+排出、加速肌漿網(wǎng)對Ca2+攝取，最終降低細胞內(nèi)Ca2+濃度而舒張血管。當(dāng)持續(xù)應(yīng)用硝酸酯類藥物后血管壁-SH逐漸減少或被亞硝?；?，導(dǎo)致硝酸酯源性NO生成減少或sGC活性下降而產(chǎn)生耐藥；此外，持續(xù)應(yīng)用硝酸酯還可以使RAAS激活、血管緊張素Ⅱ水平升高產(chǎn)生大量·O2-?！2-不但可以與NO反應(yīng)形成過氧亞硝基陰離子，削弱NO對sGC的活化作用，還能使sGC非血紅素結(jié)合位點的-SH被氧化而失活，導(dǎo)致cGMP生成減少、血管舒張減弱[8]。這是硝酸酯耐藥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，影響硝酸酯藥效。

NAC的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有活性-SH，不僅能為硝酸酯生物轉(zhuǎn)化提供活性-SH，而且能有效清除體內(nèi)的活性氧成分、保護酶的活性。本研究通過在動脈粥樣硬化兔中持續(xù)給予長效硝酸酯類藥物分析NAC抗硝酸酯耐藥的效果及機制。血管舒張反應(yīng)測定發(fā)現(xiàn)，NT組在不同濃度NTG作用下的舒張反應(yīng)均明顯弱于其他組，提示短間隙應(yīng)用ISMN不僅導(dǎo)致了血管耐藥性的產(chǎn)生，而且對NTG產(chǎn)生了交叉耐藥。當(dāng)加用NAC后，NT+NAC組的血管舒張反應(yīng)較NT組顯著改善，提示NAC可有效改善ISMN的耐藥效果，維持血管舒張活性。

血管組織生化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-SH含量由高至低依次為正常組、AS組、NT+NAC組、ISMN組以及NT組。·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量：正常組、AS組、NT+NAC組、ISMN組、NT組呈升高趨勢；AS組、正常組、NT+NAC組、ISMN組、NT組的SOD含量呈降低趨勢。提示ISMN可使-SH消耗增加，且隨用藥間隙的縮短消耗增多，加用NAC后可使組織T-SH水平顯著升高?？诜﨨AC可能具有清除活性氧物質(zhì)、恢復(fù)SOD活性的作用。

表1 各組于不同濃度NTG時的血管舒張幅度（n=8，%）

表2 各組腹主動脈生化指標(biāo)測定值比較（n=8）

[1] Jabs A,Oelze M,Mikhed Y,et al. Effect of soluble guanylyl cyclase activator and stimulator therapy on nitroglycerin-induced nitrate tolerance in rats[J]. Vascul Pharmacol, 2015,71(S1):181-91.

[2] Leo CH,Fernando DT,Tran L,et al. Serelaxin Treatment Reduces Oxidative Stress and Increases Aldehyde Dehydrogenase-2 to Attenuate Nitrate Tolerance[J]. Front Pharmacol,2017,8:141.

[3] 李紅,譚理連,嚴(yán)家榮,等. 兔腹主動脈粥樣硬化動物模型的建立[J].中華實驗外科雜志,2014,31(2):235.

[4] Daiber A,Münzel T. Organic Nitrate Therapy, Nitrate Tolerance,and Nitrate-Induced Endothelial Dysfunction: Emphasis on Redox Biology and Oxidative Stress[J]. Antioxid Redox Signal,2015,23(11):899-942.

[5] Fran?asilva MS,Balarini CM,Cruz JC,et al. Organic nitrates: past,present and future[J]. Molecules,2014,19(9):15314-23.

[6] 關(guān)文龍,竇豆,高遠生. 可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的調(diào)節(jié)機制及與心血管疾病治療關(guān)系[J]. 生理科學(xué)進展,2011,42(6):431-6.

[7] 潘潔,鐘方芳,王紅艷,等. 可溶性鳥苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其分子機制研究[J]. 國科學(xué):化學(xué),2014,44(4):572-85.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會,中華心血管病雜志編輯委員會. 硝酸酯在心血管疾病中規(guī)范化應(yīng)用的專家共識[J]. 中華全科醫(yī)師雜志,2012,11(10):725-8.