陳晨，胡佳云，戴紅芬，羅雪亭，劉旭光，徐慶，呂永楠，徐紅梅

不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）的病理基礎(chǔ)主要是冠狀動(dòng)脈（冠脈）內(nèi)皮下不穩(wěn)定斑塊破裂、出血及繼發(fā)血栓形成，也是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┌l(fā)展中一個(gè)不可預(yù)測(cè)的原因[1-5]。UAP的發(fā)生與冠脈狹窄程度無(wú)關(guān)，而與斑塊的不穩(wěn)定性和繼發(fā)血栓形成密切相關(guān)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明炎癥反應(yīng)與UAP的斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（AS）中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及其分泌的炎性細(xì)胞介質(zhì)，特別是一些細(xì)胞因子在局部的相互誘生、協(xié)同作用，促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的破裂[6-11]。最近研究顯示，UAP受檢者血清白介素-6（IL-6），白介素-17A（IL-17A）水平高于正常，提示IL-6，IL-17A可作為UAP斑塊破裂的血清學(xué)標(biāo)志物，有利于急性冠脈綜合征（ACS）的早期識(shí)別和干預(yù)[12-17]。但目前對(duì)于這些細(xì)胞因子的檢測(cè)，大部分在發(fā)病24 h后采集受檢者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定（ELISA），對(duì)于急性受檢者，發(fā)病24 h后采集檢測(cè)，并不能反映出早期檢測(cè)，早期診斷，同時(shí)由于使用ELISA檢測(cè)，又要耗時(shí)24 h以上，因此本文建立了一種更快捷、簡(jiǎn)單、有效的檢測(cè)方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀或者實(shí)時(shí)定量PCR檢查胞內(nèi)細(xì)胞因子的變化，不但能準(zhǔn)確的檢測(cè)到細(xì)胞因子（IL-6，IL-17A）在UAP受檢者中升高，同時(shí)更早檢測(cè)到IL-6，IL-17A在急性心肌梗死（AMI）和不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）受檢者的變化，真正為UAP的早期識(shí)別和早期干預(yù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取湖北中醫(yī)藥大學(xué)心內(nèi)科2016年5月～12月收治的心絞痛受檢者135例，其中UAP受檢者85例、穩(wěn)定型心絞痛（SAP）受檢者50例，另選擇同期非冠心病受檢者37例為對(duì)照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)制定的UAP診斷和治療建議確診UAP受檢者[18]；SAP受檢者根據(jù)慢性SAP診斷治療指南確診，并且受檢者病情穩(wěn)定；對(duì)照組均經(jīng)冠脈造影排除冠心病。所有受檢者除外腫瘤、肝腎功能不全、近期感染及其他免疫性疾病。所有受檢者均簽署知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 APC-anti-human IL-6 mAbs，APC-anti-human IL-17A mAbs，PE-anti-human CD4，PE-anti-human CD14 mAbs，流式細(xì)胞儀用破膜劑、穿孔劑購(gòu)自eBioscience公司；RPMI 1640，DMEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gbico BRL公司；RNA提取試劑盒購(gòu)子QIAGEN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 ①血清采集及細(xì)胞因子測(cè)定：UAP、SAP受檢者及對(duì)照者均在就醫(yī)后冠狀動(dòng)脈造影前6 h和12 h各取10 ml外周靜脈血，室溫靜置1 h，離心后收集上清血清液貯存于-80℃冰箱內(nèi)備用。應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定IL-6、IL-17A（ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司）。②外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的制備：抽取靜脈血20 ml，肝素抗凝，將抗凝血加到人淋巴細(xì)胞分層液上（保持界面清晰），2000 rpm，離心20 min；用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入適量PBS，混勻，室溫1500 rpm，離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌一次；用基礎(chǔ)RPMI-1640 1ml定容，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-6和IL-17A的分泌：制備的單個(gè)核細(xì)胞接種到24孔板，1×106細(xì)胞/孔，加2ml RPMI-1640完全培養(yǎng)基。加入PMA（50 ng/ml），ionomycin（1 ug/ml）和golgiplug（1:1000）培養(yǎng)5 h，收獲細(xì)胞然后用PE-anti-human CD4，PE-anti-human CD14 mAbs分別與細(xì)胞在4℃孵育0.5 h，洗去未結(jié)合的抗體3次。破膜劑37℃孵育20 min，離心收集細(xì)胞，洗去破膜劑。分別加入穿孔劑稀釋的APC-anti-human IL-6，APC-anti-human IL-17A孵育30 min，收集細(xì)胞，洗3次，上機(jī)檢測(cè)熒光細(xì)胞百分比。④RT-PCR檢測(cè)IL-6和IL-17A的表達(dá)：用制備的單個(gè)核細(xì)胞，依照RNA提取試劑說(shuō)明書，提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以合成的cDNA為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。根據(jù)GenBank上發(fā)表的IL-17，IL-6序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參。序列如下：GAPDH-F：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'GAPDH-R5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；IL-17-F：5'-TGCCCCAACTCCTTCCGGCT-3'，IL-17-R：5'-GGGTTCCTGAGGGGCTGGGT-3'；IL-6-F：5'-GGCTCATTCTGCCCTCGAGCC-3'，IL-6-R：5'-GGACCGAAGGCGCTTGTGGAG-3'，退火溫度56℃。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。指標(biāo)行正態(tài)性檢驗(yàn)符合近似正態(tài)分布。計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者一般資料比較 三組受檢者在年齡、性別比、吸煙史、高血壓、糖尿病、慢性肺臟疾病病史、血脂水平方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表1。

2.2 ELISA法檢測(cè)結(jié)果 在受檢者發(fā)病6 h，可以看出UAP組IL-6，IL-17A具有升高趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，發(fā)病12 h UAP組細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SAP組相比，發(fā)病12h UAP組細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，發(fā)病6h SAP組與UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SAP組相比，發(fā)病6h UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，發(fā)病12h SAP組與UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，發(fā)病12h UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，發(fā)病12h SAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖1～2。

表1 三組受檢者的一般情況表

表2 三組受檢者不同時(shí)間血清中IL-6、IL-17A的水平（±s）

表2 三組受檢者不同時(shí)間血清中IL-6、IL-17A的水平（±s）

注：IL-6：白介素-6；IL-17A：白介素-17A；與對(duì)照組相比，aP＜0.05； 與SAP組相比，bP＜0.05

組別 IL-6 IL-17A 6 h 12 h 6 h 12 h對(duì)照組（n=37） 20±9.6 11±4.8 4±1.9 6.2±1.6 SAP（n=50） 22±9.6 18±6.2 4±2.6 7±2.4 UAP（n=85） 24±9.6 45±8.8ab 5±1.3 14±3.2ab

圖1 流式細(xì)胞以檢測(cè)三組受檢者發(fā)病6 h后外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-6、IL-17A的水平（注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05； 與SAP組相比，bP＜0.05）

圖2 流式細(xì)胞以檢測(cè)三組受檢者發(fā)病12 h后外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-6、IL-17A（注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05； 與SAP組相比，bP＜0.05）

2.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果相似，與對(duì)照組相比，發(fā)病6h SAP組與UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SAP組相比，發(fā)病6h UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，發(fā)病12h SAP組與UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平都明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，發(fā)病12h UAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，發(fā)病12h SAP組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖3A、1B。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)四組受檢者發(fā)病6 h、12 h后外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-6、IL-17A的水平（注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05； 與SAP組相比，bP＜0.05）

3 討論

研究表明炎癥可以通過(guò)炎癥分子促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。作為炎癥分子，白細(xì)胞介素6（IL-6）在炎癥發(fā)生，發(fā)展中扮演重要作用[7,14-16]。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處的血管新生，促進(jìn)肉芽腫的形成，在粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)條紋單純纖維斑塊中能檢出高濃度的IL-6[16,19-21]，當(dāng)斑塊有炎癥反應(yīng)或破裂時(shí)，血中IL-6濃度升高[6,7,16,17,22,23]，因此IL-6被認(rèn)為是冠脈局部斑塊和外周血循環(huán)的炎癥標(biāo)志物之一。另有研究表明UAP受檢者的IL-6血漿濃度與嚴(yán)重冠脈事件的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān), 可作為UAP受檢者疾病突發(fā)的血清標(biāo)志物[14,19]。

IL-17A是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，它由激活的CD4+T淋巴細(xì)胞分泌，目前研究表明它可參與T淋巴細(xì)胞與造血系統(tǒng)的相互作用，其主要生物學(xué)功能是可刺激多種其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-6、白介素-8（IL-8）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和前列環(huán)素2（PGE2）。它通過(guò)刺激IL-6和PGE2的產(chǎn)生，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。特別誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子（ICAM）產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞反應(yīng)。IL-17A通過(guò)上述作用參與炎癥反應(yīng)過(guò)程[24]。IL-17A受體在體內(nèi)的廣泛存在，也提示IL-17A具有比較重要和廣泛的生物學(xué)活性。由此可見IL-6，IL-17A都在炎癥的發(fā)生和形成中起到重要作用，同時(shí)已經(jīng)有報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在UAP受檢者血清中IL-6，IL-17A濃度升高，但這些報(bào)道都沒(méi)有明確血清中細(xì)胞因子升高的時(shí)間點(diǎn)，很難作為UAP診斷識(shí)別的依據(jù)。

本研究利用流式細(xì)胞儀和實(shí)時(shí)定量PCR的方法，通過(guò)嚴(yán)格的時(shí)間點(diǎn)限制，發(fā)現(xiàn)在UAP受檢者中，發(fā)病6 h，細(xì)胞因子IL-6，IL-17A已經(jīng)明顯升高，而此時(shí)血清中細(xì)胞因子的濃度并沒(méi)有明顯變化，當(dāng)血清中細(xì)胞因子升高時(shí)，胞內(nèi)細(xì)胞因子升高的更加明顯，同時(shí)我們首次發(fā)現(xiàn)對(duì)于SAP受檢者，在發(fā)病早期，其細(xì)胞因子IL-6也有明顯的升高，由此可以推斷細(xì)胞因子IL-6，IL-17A在炎癥發(fā)生過(guò)程中，作為標(biāo)志物能更早的反應(yīng)出來(lái)炎癥變化的程度，也更能靈敏的反映出受檢者的病情，同時(shí)說(shuō)明通過(guò)胞內(nèi)細(xì)胞因子和RT-PCR的方法檢測(cè)比傳統(tǒng)ELISA法更敏感，特異性也更好。當(dāng)然在檢測(cè)中我們并沒(méi)有明確這些細(xì)胞因子的升高是由于細(xì)胞本身受到炎癥刺激分泌增高，還是由于受到其他細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致的升高，同時(shí)這些分泌細(xì)胞的細(xì)胞因子是外周血循環(huán)的細(xì)胞還是由于斑塊破裂釋放到外周血的細(xì)胞，這是后面需要通過(guò)純化細(xì)胞，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，以及動(dòng)物模型進(jìn)一步明確的問(wèn)題。

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