馬 瑞，李常軍，李文濤，張秀梅

(中國海洋大學水產(chǎn)學院,山東青島 266003)

線形硬毛藻Chaetomorpha linum隸屬于綠藻門Chlorophyta、綠藻綱Chlorophyceae、剛毛藻目Cladophorales、剛毛藻科Cladophoraceae、硬毛藻屬Chaetomorpha,主要繁殖方式包括有性繁殖、無性繁殖和營養(yǎng)繁殖[1]。線形硬毛藻在富營養(yǎng)化水體中常占據(jù)優(yōu)勢地位,形成大規(guī)模草叢[2],同時其較高的光合作用速率可以提高水體溶解氧水平,腐敗分解后釋放多種元素,影響水體的化學過程和物質組成[3]。線形硬毛藻作為綠潮藻類的優(yōu)勢種之一,國內(nèi)外學者對它的研究多集中在營養(yǎng)鹽吸收方面[4]。如MCGLATHERY,et al[5]研究表明,在氮限制的情況下,線形硬毛藻會加快對NH4+的吸收速度,而對NO3-的吸收滯后;在氮充足的情況下,會優(yōu)先吸收NH4+而抑制對NO3-的吸收;KRAUSE-JENSEN,et al[6]研究表明線形硬毛藻在高光照強度條件下比在低光照強度條件下可以更有效地阻止NH4+向上層水中擴散,光期比暗期吸收量更大。另外,有關線形硬毛藻的生長和物質積累方面也有一些報道,如XU,et al[7]研究了溫度、鹽度和光照強度對于線形硬毛藻生長影響的最佳組合。

光是調(diào)控植物生長發(fā)育的關鍵生態(tài)因子之一,而光質是光的重要屬性[8-9]。藻類對光質的吸收具有選擇性,光質對藻類的生長發(fā)育、形態(tài)建成、光合作用和物質代謝等具有重要的調(diào)控作用[10-14],直接影響藻類的生長和發(fā)育。目前,對于線形硬毛藻的研究多集中在營養(yǎng)鹽吸收[15]、溫度[7]、鹽度[7]和光照強度[16]等方面,而關于光質對于線形硬毛藻生長發(fā)育及其理化指標的影響研究甚少。鑒于此,本文利用發(fā)光二極管(LED)作為光源,探討紅光(R)、藍光(B)、紅光：藍光=3：1(3RB)、紅光：藍光=1：1(RB)、紅光：藍光=1：3(R3B)和紅光：綠光：藍光=1：1：1(RGB)2種單色光及4組混合光對線形硬毛藻生理生化指標的影響,為綠潮藻類的后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗用線形硬毛藻于2016年11月采自山東省榮成市天鵝湖(37°21′N,122°34′E),測得天鵝湖實時水溫13.5℃,鹽度31.76、DO 8.2 mg/L。挑選色澤艷麗,生長狀態(tài)良好的線形硬毛藻,伴隨少量海水置于保溫箱內(nèi)低溫避光保存,并于采樣當天將樣品運回實驗室。

1.2 藻體暫養(yǎng)

將運回實驗室的藻體用過濾海水反復清洗以去除藻體表面的附生生物及雜質,將挑選健康且生長狀態(tài)一致的藻體置于實驗室循環(huán)水槽(70 cm×40 cm×50 cm)內(nèi)培養(yǎng) 7～10 d,期間光照強度為 60 μmol·m-2·s-1,光周期為12 L：12 D,同時,保持每天1℃的速度給水槽內(nèi)海水升溫,每天更換1次全部海水。

1.3 實驗設計

使用1 000 mL燒杯作為實驗用培養(yǎng)瓶,隨機稱量4份相同鮮重(3.0±0.1 g)的藻體,分別置于不同培養(yǎng)瓶中,并向培養(yǎng)瓶中注入800 mL滅菌的PES培養(yǎng)液。用保鮮膜將培養(yǎng)瓶封口,并用細針在保鮮膜上穿孔20個,既防止培養(yǎng)液蒸發(fā)鹽度升高,又保持了氣體的交換。將培養(yǎng)瓶置于一不透光的紙箱(60 cm×60 cm×75 cm)內(nèi),不同紙箱內(nèi)設有不同光質(R、G、B、3RB、RB、R3B、RGB)的 LED 排燈照射,通過氣泵向每個培養(yǎng)瓶注入空氣,注入空氣的速度以藻體可以在培養(yǎng)瓶中緩慢移動為好。

實驗用光源為11 W的LED排燈,其中紅光波長700 nm,藍光波長450 nm,綠光波長550 nm,通過調(diào)整排培養(yǎng)瓶與光源之間的距離,保證照著到培養(yǎng)瓶處的光照強度為60 μmol·m-2·s-1,光照強度使用LI-250 A便攜式光照儀進行測定。培養(yǎng)期間溫度恒定于25℃,光周期12 L：12 D,培養(yǎng)時間為10 d。

1.4 樣品測定

1.4.1 特定生長率(SGR)

實驗結束后,稱量每組藻體的濕重,運用以下公式計算藻體的特定生長率(SGR)。

式中,Wt為實驗結束時藻體的濕重(g);Wo為實驗開始時藻體的濕重(g);t為實驗時間(d)。

1.4.2 葉綠素a含量

實驗開始前稱取4份濕重為0.3±0.01 g的藻體置于-80℃冰箱內(nèi)冷凍保存,用于藻體葉綠素a的初始值測定;實驗結束時,每個培養(yǎng)瓶隨機稱取0.3±0.01 g的藻體,用于測定實驗后藻體的葉綠素a含量[17]。測量方法采用可見光法,公式如下：

式中：OD663為663 nm波長處的渾濁度校正值;OD645為645 nm波長處的渾濁度校正值;OD630為630 nm波長處的渾濁度校正值。

1.4.3 抗氧化酶及丙二醇的測定

實驗開始前隨機取部分藻體于-80℃冰箱內(nèi)冷凍保存,用于抗氧化酶及丙二醇初始值的測定?？偝趸锲缁?SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醇(MDA)的測定均采用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的總超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醇(MDA)試劑盒進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0和Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗不同光質處理對線形硬毛藻各生理生化指標的差異顯著性,將P＜0.05設為差異顯著水平,P＜0.01設為差異極顯著水平,圖中數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 特定生長率及單位長度細胞數(shù)量

培養(yǎng)10 d結束后,各光質處理下線形硬毛藻的特定生長率存在極顯著差異(P＜0.01)(圖1)?？傮w來看,在復合光質下培養(yǎng)的藻體要比在單色光質下培養(yǎng)的藻體生長的更快;在復合光質中,隨著藍光比例的增加,藻體的特定生長率在不斷上升,呈現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。其中,RGB光質組培養(yǎng)下藻體生長最快(6.63%),R3B光質組次之(6.44%),而紅光處理下的藻體生長最慢(4.11%)。觀察RB和RGB培養(yǎng)組可發(fā)現(xiàn),綠光的加入對藻體的生長有明顯的促進作用(P＜0.05),RGB光質組藻體增重是RB組的1.09倍。

圖1 線形硬毛藻在不同光質下的特定生長率Fig.1 The SGR of C.linum under different light qualities

圖2 不同光質培養(yǎng)條件下線形硬毛藻的葉綠素a含量Fig.2 The contents of Chl a of C.linum under different light qualities

圖3 不同光質條件下線形硬毛藻的SOD活力Fig.3 SOD activity of C.linum under different light qualities

2.2 光合色素葉綠素a含量

不同光質處理下線形硬毛藻體內(nèi)葉綠素a含量存在極顯著性差異(P＜0.01)。從圖2可以看出,RB、R3B、RGB光質處理組藻體內(nèi)葉綠素a含量大于實驗培養(yǎng)前的初始值,而R、B、3RB光質處理組藻體內(nèi)葉綠素a含量小于初始值,RB光質組培養(yǎng)下的藻體葉綠素a含量顯著高于其他各處理組(P＜0.05),是初始值的1.44倍,是紅光處理組的2.78倍。加入綠光的RGB光質處理組相較于RB光質處理組來說,葉綠素a含量略低,說明綠光的加入不利于線形硬毛藻葉綠素a的累積。

2.3 抗氧化酶活力

不同光質處理下線形硬毛藻體內(nèi)SOD活力存在極顯著性差異(P＜0.01)。從圖3可看出,各組光質處理培養(yǎng)的藻體,其體內(nèi)的SOD活力均高于初始值,其中復合光質組的SOD活力要高于單色光質組,但無論在紅、藍單色光質中比較,還是在復合光質中按光質的比例來看,隨著紅光所占比例的增加,藻體內(nèi)SOD的活力在不斷增強,說明紅光有利于線形硬毛藻體內(nèi)SOD活力的提升。比較RB光質組和RGB光質組可以看出,綠光的加入不利于藻體SOD活力的提升。

總體來看,藻體內(nèi)CAT活力的變化規(guī)律與SOD活力的變化規(guī)律基本一致,但經(jīng)單因素方差分析檢驗,不同光質處理對藻體內(nèi)CAT活力無顯著影響(P＞0.05)。

2.4 丙二醛

不同光質處理下線形硬毛藻體內(nèi)MDA含量存在極顯著性差異(P＜0.01)(圖5)。從總體來看,單色光質組培養(yǎng)的藻體內(nèi)MDA含量要高于復合光質組培養(yǎng)的藻體,單色光質組MDA含量高于初始值,復合光質組MDA含量低于初始值(圖5)。從圖5還可以看出,無論在紅、藍單色光質中比較,還是在復合光質中按光質的比例來看,隨著藍光所占比例的增加,藻體內(nèi)MDA含量在不斷增強,說明藍光可以促進線形硬毛藻體內(nèi)MDA的累積。比較RB光質組和RGB光質組可以看出,綠光的加入不利于藻體MDA的累積。

圖4 不同光質條件下線形硬毛藻的CAT活力Fig.4 CAT activity of C.linum under different light qualities

圖5 不同光質培養(yǎng)條件下線形硬毛藻的MDA含量Fig.5 The contents of MDA of C.linum under different light qualities

3 討論

光作為最重要的生態(tài)因子之一,不僅給植物的光合作用提供了必要的能源,同時也對植物的形態(tài)建成起調(diào)控作用[18]。光質作為光的重要屬性,是通過被植物體內(nèi)的光敏色素感知,從而影響植物的生長發(fā)育、光合作用、形態(tài)建成和生理代謝[19]。大量研究證實,光質對藻類的生長繁殖、光合色素的含量組成[20-24]以及酶活性[25]均有一定的影響。本研究表明,相較于單色光質組(R、B)來說,復合光質組(3RB、RB、R3B、RGB)更有利于線形硬毛藻生物量的積累,這一結果與中肋骨條藻Skeletonema costatum[26]和草莓[27]的研究結果一致,說明各種光質相互協(xié)調(diào),共同作用更有利于植物的生長發(fā)育。在復合光質組中,藍光比例的增加明顯有利于線形硬毛藻體的生長,這與壇紫菜自由絲狀體[9]、扁滸苔Ulva compressa[14]的研究結果類似。但也有研究發(fā)現(xiàn),紅光對江蘺Gracilaria fisheri[23]和角叉菜Chondrus ocellatus[28]的促生長作用明顯優(yōu)于藍光,作者認為造成這種差異的原因可能是不同藻體內(nèi)所含光合色素的含量和組成不同,使其對于可見光各個波段的吸收率和利用率不同。

光合色素是藻類進行光合作用的物質基礎,能夠吸收、傳遞和轉換光能,而在光合作用的過程中,葉綠素a直接參與光反應階段[9],因此葉綠素a的含量是反應植物光合作用能力的重要指標。本研究表明,復合光質組的葉綠素a含量明顯高于紅、藍單色光,說明復合光更有利于線形硬毛藻光合色素的累積。RB光質組葉綠素a含量最高,顯著高于RGB光質組(P＜0.05),說明綠光的加入不利于線形硬毛藻光合色素的累積。

SOD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,會對植物產(chǎn)生一定程度的保護作用[29],其中SOD能催化超氧化物陰離子自由基發(fā)生歧化反應,將活性氧代謝維持在平衡水平,保護膜結構[30],CAT則可以分解代謝產(chǎn)生的H2O2,從而有效地清除自由基[31]。植物體內(nèi)的光敏色素會對不同的光質作出響應,從而影響植物的抗氧化系統(tǒng)[32]。研究表明,光能吸收與利用的平衡常常會被逆境條件打破,從而導致吸收光能過剩以及氧自由基的產(chǎn)生,而這些活性氧會損害植物的生理功能,破壞SOD、CAT等抗氧化酶的含量、結構,影響膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性,最終導致膜脂過氧化,破壞膜的結構,對植物產(chǎn)生極其嚴重的傷害[29,33]。本研究表明,實驗中經(jīng)過各組光質培養(yǎng)的藻體內(nèi)SOD活力均高于初始值,可能是實驗光質均對藻體的生長發(fā)育產(chǎn)生了脅迫,抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮保護作用,使得SOD活力上升。復合光質組SOD活力高于單色光質組,結合藻體在各組光質培養(yǎng)下的生長情況,分析認為,雖然各組光質均對藻體的生長產(chǎn)生脅迫,但單色光質組(R、B)產(chǎn)生的脅迫較強,嚴重影響了藻體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的正常水平,使得SOD活力下降。本研究發(fā)現(xiàn),實驗光質組對藻體內(nèi)CAT活力的影響不顯著(P＞0.05)。分析認為,SOD可將藻體內(nèi)O2-轉化為H2O2,CAT進一步將H2O2轉化為無毒性的H2O和O2從而起到保護膜結構的作用,而CAT活力的定義為每mg組織蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位,但實驗中藻體培養(yǎng)時間較短,不同光質照射僅對藻體SOD活力產(chǎn)生影響,未達到對CAT影響的培養(yǎng)時間。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一,可通過MDA了解膜脂過氧化的程度,以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[34]。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合,SOD的活力高低間接反應了機體清除氧自由基的能力,而MDA的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。大量研究證明,植物在受到嚴重脅迫的情況下,其體內(nèi)的MDA含量有明顯的升高。本研究表明,復合光質組的藻體內(nèi)MDA含量均低于初始值,單色光質組的藻體內(nèi)MDA含量高于初始值,結合各組光質對藻體SOD和CAT活力的影響,表明紅、藍單色光相比于復合光對藻體產(chǎn)生了更大的脅迫,SOD、CAT的活力下降導致活性氧的積累,過量的活性氧加劇了膜脂過氧化作用,這與番茄[35]和水稻[36]的研究結果一致。

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