鮑紅榮

（浙江省臨安市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，浙江 杭州 311300）

敵敵畏(dichlorvos)為四大有機(jī)磷農(nóng)藥之一，殺蟲效果顯著,被廣泛應(yīng)用于各類農(nóng)作物。其毒性中等，大鼠急性經(jīng)口半數(shù)致死量（LD50)為 56～80 mg/kg，急性經(jīng)皮 LD50為 75～105 mg/kg。臨床上，敵敵畏中毒很常見，目前多采用血液灌流的方法治療其急性中毒[1]。敵敵畏的檢測分析方法主要有薄層層析-容量法[2]、氣相色譜法等[3-5]，但前者操作煩瑣、分析周期長、工作強(qiáng)度大，后者不適于分析高沸點(diǎn)有機(jī)物、高分子和熱穩(wěn)定性差的化合物。目前已有應(yīng)用高效液相色譜法檢測蔬菜、水體中有機(jī)磷農(nóng)藥的報(bào)道[6-7]，但少有此法用于測定血清中敵敵畏質(zhì)量濃度的報(bào)道。筆者就此進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型Series高效液相色譜儀（附紫外檢測器，色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)）；HP-7550型電腦檢測儀；Anke TGL-18G-C型高速離心機(jī)；SZ-1型快速混勻器；AL104型電子天平。敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品（迪馬科技公司）；卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；色譜純乙腈、重純化水均過0.45!m微孔濾膜。

表1 日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流動(dòng)相：乙腈 -水（50 ∶50)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：211 nm；進(jìn)樣量：10!L；柱溫：40 ℃ 。在此色譜條件下，內(nèi)標(biāo)峰與樣品色譜峰能達(dá)到基線分離，卡馬西平保留時(shí)間為4.43 min,敵敵畏保留時(shí)間為5.00 min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品0.060 2 g，置50 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為1 200!g/mL的溶液，再將此溶液分別配制成 3，15，30，75，150，300，600!g/mL 的溶液，冰箱低溫存放，即為敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品0.010 2 g，置10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，再用移液管精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加乙腈至刻度，得質(zhì)量濃度為100!g/mL的卡馬西平溶液，即內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取80%的敵敵畏乳油0.020 2 g，置50 mL量瓶中，用乙腈溶解至刻度，配制成敵敵畏質(zhì)量濃度為320!g/mL的溶液，即為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取空白血清100!L，置2 mL一次性尖底具塞離心試管中，分別加入各種質(zhì)量濃度的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液100!L與卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液100!L，將試管放入快速混勻器混合15 s，以12 000 r/min高速離心10 min，精密吸取上清液10!L進(jìn)樣測定，平行操作6次，以平均峰面積比值對(duì)質(zhì)量濃度擬合，得回歸方程為Ai/As=0.022 5+0.003 8C，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，敵敵畏質(zhì)量濃度線性范圍是3～600!g/mL，最低檢測濃度為0.5!g/mL。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10!L，分別于室溫下0，1，2，4，24 h時(shí)進(jìn)樣，在所選色譜條件下測定。結(jié)果峰面積的 RSD為1.18%（n=5），表明在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

精密度試驗(yàn)：吸取敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液10!L，連續(xù)進(jìn)樣5次,在上述色譜條件下測定峰面積。再按日間精密度同法操作，連續(xù)進(jìn)行6 d。結(jié)果見表1。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液5份，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下操作制備血清樣品，精密吸取10!L進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果的 RSD為2.16%（n=5）,表明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗(yàn)：精密吸取低、中、高3種質(zhì)量濃度的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液各100!L，每種質(zhì)量濃度各6份，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下操作，結(jié)果見表2。

3 討論

為保證各樣品之間以及樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)的條件完全一致，各項(xiàng)操作一定要盡量平行一致，以減少誤差。高效液相色譜法進(jìn)樣量小，很難控制每次進(jìn)樣量都完全相等，且其他一些原因如操作熟練程度、溶劑揮發(fā)性也會(huì)影響到色譜響應(yīng)值，而應(yīng)用內(nèi)標(biāo)定量法可消除這些因素引起的誤差，還可簡化操作，使操作易于掌握。因此，選擇內(nèi)標(biāo)法為敵敵畏測定的定量方法。

選擇一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)，對(duì)于測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度具有重要意義。因此，要求內(nèi)標(biāo)物必須是樣品中不含有的組分，即不應(yīng)是患者可能同時(shí)服用的其他藥物；內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間應(yīng)與待測組分接近，但能完全分開，即分離度 R≥1.5；內(nèi)標(biāo)物有足夠的純度?？R西平既不是體內(nèi)內(nèi)源性成分，也不是藥物在體內(nèi)可能產(chǎn)生的代謝物,且在210 nm波長處有較大的吸收[8]，與敵敵畏峰的分離度 R不低于1.5，基本符合敵敵畏測定時(shí)內(nèi)標(biāo)物的要求。

孫志偉等[9]對(duì)敵敵畏在190～300 nm波長范圍內(nèi)紫外掃描，發(fā)現(xiàn)敵敵畏在211 nm波長處有最大吸收，且雜質(zhì)在此波長處吸收很小，而卡馬西平也有較好吸收。筆者實(shí)際測定后也發(fā)現(xiàn)在此波長處兩種物質(zhì)均有較好出峰且分離度較好，故選定211 nm為檢測波長。

多篇文獻(xiàn)均選擇流動(dòng)相為甲醇-水體系，于是在Zorbax SBC18柱上，以甲醇-水體系作流動(dòng)相，按不同比例進(jìn)行了恒流洗脫試驗(yàn)，測定后發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰較多，且峰的分離度不好。因供試品溶液配制時(shí)溶劑為乙腈，故將流動(dòng)相改為1∶1的乙腈-水[10]，測定后發(fā)現(xiàn)柱效最高，敵敵畏與卡馬西平的峰形與分離度都較好，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水（50∶50）。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

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