黃燕瓊，鄧 艷，張 森，何淑華，戴 金，柏建山

（1.廣州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局/國家水產(chǎn)品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510470；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

顎口線蟲病是一種食源性疾病，由旋尾目（spirurid）的顎口線蟲引起。當(dāng)人體食入生的或未熟的感染顎口線蟲的食物后可能感染顎口線蟲，引起移行性皮下包塊和匐行疹，蟲體也可侵入人體重要器官，如肝臟、腎臟、肺臟、眼睛甚至中樞神經(jīng)系，引起嚴(yán)重后果甚至死亡［1］。目前，顎口線蟲有13個有效種、5個致病種（4種分布在亞洲，1種分布在拉丁美洲）。棘顎口線蟲是亞洲地區(qū)的主要致病種，首次被發(fā)現(xiàn)是在倫敦動物園的老虎胃內(nèi)。剛刺顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲病例主要發(fā)生在日本［2］，雙核顎口線蟲是拉美地區(qū)流行的唯一蟲種［3］。在墨西哥和泰國，已報(bào)道的病例均超過9 000例，日本病例4 000例［4］。

感染人體患病的主要是顎口線蟲第三期幼蟲，其宿主廣泛，其中淡水魚是顎口線蟲的重要宿主，也是感染人體的重要來源。在淡水魚中，泥鰍和黃鱔的感染率非常高，這兩種魚類在亞洲地區(qū)廣泛存在，在很多調(diào)查中，黃鱔的感染率很高［5］，在東南亞有些地區(qū)黃鱔的感染率可達(dá)100%，泥鰍中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)顎口線蟲。本調(diào)查對從廣州機(jī)場口岸入境的黃鱔以及國內(nèi)的黃鱔、泥鰍感染情況進(jìn)行調(diào)查和分類鑒定，以期為顎口線蟲的防控提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 國外蟲體來源于廣州機(jī)場口岸入境的黃鱔，進(jìn)口自印度尼西亞和菲律賓。國內(nèi)蟲體來源于不同地區(qū)市場所售泥鰍和黃鱔，包括廣東廣州、福建漳州、吉林長春、重慶、四川內(nèi)江、湖北荊州。

1.1.2 主要儀器 生物顯微鏡（Lecia DM5000B）、體視顯微鏡（Lecia S8APO）、恒溫振蕩器（THZ-D）、冷凍離心機(jī)（Siama 3K15）、梯度PCR儀（BIOMETRA TRRADIENT） 、電泳儀（BIA-RAD、PowerPac Basic）、凝膠成像系統(tǒng)（VILBER）、手術(shù)刀、小鑷子、昆蟲針、載玻片、蓋玻片。

1.1.3 主要試劑 8.5 g/L生理鹽水、胃蛋白酶-濃鹽酸消化液、酒精、乳酸-酚-甘油混合透明液，試劑配制方法參照《淡水魚中寄生蟲檢疫技術(shù)規(guī)范》和《水產(chǎn)品中顎口線蟲檢疫技術(shù)規(guī)范》。TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒、10×PCR buffer、dNTP、Taq酶、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 顎口線蟲蟲體的分離 逐條剖開黃鱔，檢查腹腔內(nèi)蟲體感染情況，再分離頭部，剪碎肌肉和肝臟后，用消化液對其進(jìn)行消化，過夜消化至消化液內(nèi)無明顯組織，將消化液濾過孔徑2.0 mm的篩，吸去上清液，加水?dāng)嚢韬蟪恋?0～30 min，再吸去上清液，用清水反復(fù)清洗幾次，直至上清液透明為止，分離出蟲體，置于有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。泥鰍的消化方法與黃鱔類似，但由于泥鰍個體偏小，沒有逐條進(jìn)行消化，而是直接稱重，數(shù)條泥鰍一起消化。

1.2.2 蟲體的形態(tài)學(xué)鑒定 用體視顯微鏡觀察，疑似顎口線蟲的蟲體發(fā)黃，頭部有棘突，卷曲，體長一般2～5 mm，在生理鹽水中卷曲或有包囊包住，將蟲體放入乳酚透明液中，至透明后，置于載玻片上，在生物顯微鏡下觀察。觀察鑒定后將蟲體放入裝有75%酒精的離心管中-20℃保存。

1.2.3 蟲體DNA提取 將單條蟲體從75%酒精的離心管中取出，置于經(jīng)滅菌的1.5 mL離心管中，用純水洗凈后用研磨棒研磨，后根據(jù)TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒的步驟提取蟲體基因組DNA。將基因組DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增ITS2序列 對顎口線蟲ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見表1，擴(kuò)增體系如下：2.5μL 10×PCR buffer，2.5μL Mg2+，1μL dNTP，1μL PE-5.8S引物，1μL PE-28S引物，0.5μLTaq酶，1μL DNA模板，用超純水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5μL在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。

表1 對顎口線蟲ITS2序列擴(kuò)增引物［6］

1.2.5 擴(kuò)增片段回收克隆 使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段的純化回收，將純化產(chǎn)物連接到pMD 18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中培養(yǎng)，將DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)液涂布到含有氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，再進(jìn)行藍(lán)白斑篩選（方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第3版），挑取單個白色菌落，按照Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒說明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取。將質(zhì)粒置于-20℃冰箱保存。

1.2.6 測序、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 將陽性克隆質(zhì)粒送Invitrogen公司進(jìn)行測序，校正處理獲得的序列，使用NCBI的BLAST在線工具進(jìn)行序列比對。在GenBank中獲取不同種顎口線蟲的ITS序列，包括棘顎口線蟲（G. spinigerumn，登錄號為KP784343）、杜氏顎口線蟲（G.doloresi，登錄號為AB181156）、雙核顎口線蟲（G. binucleatum，登錄號為EU334741）日本顎口線蟲（G. nipponicum，登錄號為JQ824051）、剛刺顎口線蟲（G. hispidum，登錄號為JQ824057）、膨脹顎口線蟲（G.turgidum，登錄號為KF648548）、宮崎顎口線蟲（G. miyazakii，登錄號為FJ497055）、G. lamothei（登錄號為EU334738）、美麗筒線蟲（G. pulchrum，登錄號為AB646106）。將測序結(jié)果與下載的ITS2序列用ClustalX軟件進(jìn)行差異性分析，并進(jìn)行必要調(diào)整，然后用MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetic Analysis 5.0 version）軟件，使用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展值（Bootstrap values）重復(fù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣州機(jī)場口岸入境黃鱔中顎口線蟲的檢查情況

廣州機(jī)場口岸入境的黃鱔主要來自菲律賓和印度尼西亞，這是入境水產(chǎn)品中唯一的一種淡水魚，對每一批次黃鱔進(jìn)行抽樣調(diào)查（共19批次，其中12批次來自印度尼西亞、7批次來自菲律賓）。從表2可以看出，印度尼西亞的黃鱔感染率較高，批次陽性率達(dá)到91.7%，感染強(qiáng)度1～9條不等；菲律賓黃鱔中沒有發(fā)現(xiàn)顎口線蟲。

術(shù)后兩組患者均常規(guī)使用替硝唑片(廠家：湖南迪諾制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H43020659，規(guī)格：0.5 g)抗感染治療，劑量為1 g/次，1次/d；同時采用補(bǔ)佳樂(廠家：拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20171038，規(guī)格：1 mg)加黃體酮膠囊(廠家：浙江仙琚制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20041902,規(guī)格：50 mg)治療，劑量分別為2 mg/次、100 mg/次，1日2次。以21 d為1個治療周期，停藥7 d后再進(jìn)行下1周期治療，兩組患者均治療3個人工周期。3個月后，取出人羊膜包裹球囊和節(jié)育器，并記錄兩組患者療效。

2.2 國內(nèi)部分省市市售黃鱔和泥鰍中顎口線蟲的檢查情況

2015年9～12月，對國內(nèi)廣東廣州、重慶、四川內(nèi)江、湖北荊州、福建漳州和吉林長春的部分市售黃鱔和泥鰍進(jìn)行了檢查，只在漳州的泥鰍中發(fā)現(xiàn)了18條蟲體，在黃鱔中發(fā)現(xiàn)了1條蟲體，其他地區(qū)均無發(fā)現(xiàn)蟲體（表3）。因?yàn)楸敬螜z查的時間較短、樣本有限，數(shù)據(jù)只能作為參考，需要進(jìn)一步的調(diào)查。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

在體視顯微鏡下，活體稍透明，呈黃色，頭部和尾部都向內(nèi)卷曲，呈盤旋狀；死亡蟲體呈半透明，頭部伸直，尾部向頭部卷曲呈半環(huán)（圖1 A、B，彩插四）。透明后在生物顯微鏡下觀察，蟲體表面可見到體棘，約2～5 mm，向后延伸逐漸變細(xì)；蟲體可明顯分為唇部、頭球和體部3個部分，唇部向前突出，位于頭球前端；頭球表面有棘突，內(nèi)部向下連接4個頸囊；食道與口唇相連，食道顏色較淺，從前端向后逐漸膨脹，在最膨大處于腸道相連，界限明顯，腸道較細(xì)，有彎曲，顏色深，長度大約是食道的1.5倍（圖1 C、D，彩插四）。

在高倍生物顯微鏡下進(jìn)一步觀察，初步鑒定為3種顎口線蟲，福建漳州黃鱔中蟲體為棘

顎口線蟲，泥鰍中蟲體1條為棘顎口線蟲，17條為日本顎口線蟲，印度尼西亞黃鱔中檢出9條剛刺顎口線蟲，其余全部為棘顎口線蟲。

表2 廣州機(jī)場口岸入境黃鱔中顎口線蟲的檢查情況

（1）棘顎口線蟲：蟲體較大，體長4～5 mm，各個器官清晰可見，唇部位于頭球中央頂端，有兩對突起，共兩對頸囊，每側(cè)分布1對，食道與腸道交界如漏斗狀，尾端可見肛門和尾感器，頭球表面有棘突，呈不規(guī)則長方形，共4環(huán)棘突：第一環(huán)棘突數(shù)為40～47，第二環(huán)為37～49，第三環(huán)為42～57，第四環(huán)為42～48；頸乳突位于11～16體環(huán)處。根據(jù)這些特征初步判斷為棘顎口線蟲（圖2，彩插四）。

（2）剛刺顎口線蟲：在高倍生物顯微鏡下觀察，蟲體各部分結(jié)構(gòu)符合顎口線蟲形態(tài)，頭球棘突呈不規(guī)則啞鈴型，共4環(huán)：第一環(huán)棘突數(shù)約為40，棘突數(shù)向后逐漸增加，第四環(huán)約為48；頸乳突位于9～14環(huán)體棘之間。根據(jù)以上特征初步鑒定為剛刺顎口線蟲（圖3，彩插四）。

2.4 ITS2序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

以編號為Gn-FJ1～Gn-FJ6和Gn-In1～Gn-In13的線蟲基因組DNA為模板，使用顎口線蟲ITS2通用引物PE-5.8S和PE-28S進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段約640 bp，與預(yù)期片段大小相符（圖5）。

圖5 部分顎口線蟲ITS2序列PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5 序列分析

樣品測序結(jié)果經(jīng)Blast分析比對，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13的ITS2序列與GenBank中已知的棘顎口線蟲（G. spinigerumn）相應(yīng)基因序列（登錄號為KP784343）同源性達(dá)99%～100%；樣品Gn-FJ1～Gn-FJ4與日本顎口線蟲（G. nipponicum）同源性達(dá)99%～100%（登錄號為JQ824051）；樣品Gn-In10和Gn-In11的序列比對結(jié)果與剛刺顎口線蟲（G. hispidum）同源性達(dá)100%（登錄號為JQ824057）。

2.6 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖 6 基于ITS2序列以最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

對19個樣品的ITS序列進(jìn)行多重比對后進(jìn)行必要調(diào)整，采用M-L法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。從系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)鋱D（圖6）可以看出，顎口線蟲屬對應(yīng)美麗筒線蟲構(gòu)成一個大分支，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13與棘顎口線蟲構(gòu)成自展值為99%的獨(dú)立分支，這個分支又與雙核顎口線蟲組成一個自展值為87%分支；Gn-FJ1～Gn-FJ4與日本顎口線蟲構(gòu)成自展值為90%的獨(dú)立分支；Gn-In10和Gn-In11與剛刺顎口線蟲構(gòu)成自展值為98%的獨(dú)立分支，又與杜氏顎口線蟲構(gòu)成一個自展值為98%的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分支。一些可信度比較高的分支與這些蟲體的某些特性吻合，如膨脹顎口線蟲的形體是顎口線蟲中最大的，與其他蟲體形態(tài)差異明顯，在進(jìn)化樹中獨(dú)立自成一支，說明其可能與其他蟲體的遺傳距離較遠(yuǎn)；剛刺顎口線蟲和杜氏顎口線蟲的終末宿主均為豬和野豬，它們的生活史比較接近，在進(jìn)化樹中，這兩個蟲種組成一個自展值為98%的分支，表明它們的遺傳距離較近；而棘顎口線蟲是亞洲地區(qū)的主要致病種，雙核顎口線蟲是美洲地區(qū)的主要致病種，兩者組成一個自展值87%的分支，說明兩者遺傳距離較近，是否與其致病性有一定關(guān)系還不得知，需要進(jìn)一步研究；其他蟲種分支的自展值比較低，存在很大不確定因素，需要結(jié)合其他基因作進(jìn)一步研究。

3 討論

本次從國內(nèi)的黃鱔和泥鰍中發(fā)現(xiàn)了少量顎口線蟲，集中在福建漳州地區(qū)，187條泥鰍中發(fā)現(xiàn)了18條顎口線蟲，其中17條為日本顎口線蟲、1條為棘顎口線蟲，10條黃鱔中發(fā)現(xiàn)了1條棘顎口線蟲。雖然蟲體不多，但也說明了福建漳州地區(qū)存在顎口線蟲。購買的黃鱔和泥鰍有些是通過野生捕撈獲得，有些來自人工養(yǎng)殖，這對調(diào)查的結(jié)果造成一定影響。

棘顎口線蟲是世界范圍內(nèi)廣泛的顎口線蟲，在歐亞、大洋洲、非洲、美洲都有發(fā)現(xiàn)，在我國北京、上海、江蘇、福建、廣東等10余省市均有報(bào)道，亞洲地區(qū)包括我國的絕大部分顎口線蟲病是由棘顎口線蟲引起，此次國內(nèi)的檢查中在福建漳州的黃鱔和泥鰍體內(nèi)各發(fā)現(xiàn)1條棘顎口線蟲，應(yīng)該引起高度重視。

本研究在福建首次發(fā)現(xiàn)日本顎口線蟲，2012年李雯雯等［7］在廣州和黑龍江泥鰍中分離到日本顎口線蟲，為首次在我國本土發(fā)現(xiàn)日本顎口線蟲。在此之前中國出口到韓國和日本的泥鰍中有發(fā)現(xiàn)日本顎口線蟲［8］。本研究再一次證明我國本土存在日本顎口線蟲，在國內(nèi)可能廣泛分布［9-13］，需要作進(jìn)一步調(diào)查研究。

對廣州機(jī)場口岸入境的黃鱔進(jìn)行檢查，印度尼西亞的黃鱔顎口線蟲感染率較高、為27.9%，而菲律賓黃鱔中沒有分離到顎口線蟲。印度尼西亞和菲律賓的黃鱔在入境時均申報(bào)為野外捕撈，在檢查中發(fā)現(xiàn)印度尼西亞的黃鱔大小參差不齊，體內(nèi)有大量其他寄生蟲，如棘頭蟲、吸蟲、胃瘤線蟲等蟲體，說明其生長環(huán)境復(fù)雜；而菲律賓的黃鱔體型較大且均一，體內(nèi)的寄生蟲很少，說明其生長環(huán)境單一。僅2016年，從廣州白云機(jī)場口岸入境的印度尼西亞黃鱔為1379.049 t，菲律賓黃鱔為802.659 t，而且黃鱔的入境數(shù)量逐年增長，尤其是現(xiàn)在冰鎮(zhèn)黃鱔等食用方法比較流行，但該方法并不能徹底殺死寄生在肌肉內(nèi)的顎口線蟲，因此需要特別重視入境黃鱔的寄生蟲檢疫工作［14］。

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