吳華俊，陳敬祥，林 同

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.佛山市云勇生態(tài)林養(yǎng)護(hù)中心，廣東 佛山 528518）

松墨天牛（Monochamus alternatusHope）又名松褐天牛，屬鞘翅目（Goleoptera）天?？疲–erambycidae），是危害馬尾松（Pinus massoniana）等松屬（Pinus）樹(shù)木的重要蛀干類害蟲(chóng)，也是我國(guó)重要的檢疫性有害生物［1］。松墨天牛主要危害長(zhǎng)勢(shì)較弱或?yàn)l死木，通過(guò)啃食樹(shù)干、枝條的韌皮部和木質(zhì)部攝取養(yǎng)分，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致松樹(shù)死亡［2］。松墨天牛攜帶有大量的松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus），是松材線蟲(chóng)萎蔫病的主要傳播媒介［3-4］?？刂扑赡炫７N群數(shù)量及活動(dòng)范圍是切斷松材線蟲(chóng)自然傳播途徑的有效方法［5］，在新形勢(shì)下必須通過(guò)害蟲(chóng)綜合防治技術(shù)（IPM）防控松墨天牛，而探尋新的藥物作用靶標(biāo)，設(shè)計(jì)新型環(huán)保的昆蟲(chóng)行為調(diào)節(jié)劑已成為了松墨天牛綜合防治的重要手段。

1967年，Moore等［6］在分離牛腦蛋白過(guò)程中首次發(fā)現(xiàn)了14-3-3蛋白，命名是根據(jù)該蛋白在纖維素柱層析中的片段數(shù)目以及在淀粉凝膠電泳中的遷移率而來(lái)。14-3-3蛋白是酸性蛋白，具有可溶性，廣泛存在于真核生物的細(xì)胞中，是有高度保守性的蛋白家族［7］。真核生物物種中14-3-3蛋白由同一個(gè)基因家族來(lái)編碼，動(dòng)物、植物之間的同工型相似性高達(dá)70%以上，人（Homo sapiens）14-3-3 Zeta（ζ）蛋白和酵母（Saccharomyces）14-3-3蛋白的氨基酸序列的相似性也高達(dá)70%左右［8］。在哺乳動(dòng)物中存在α～η等7個(gè)亞型，其中α是β的磷酸化形式、δ是ζ的磷酸化形式；昆蟲(chóng)如果蠅（Drosophila melanogaster）和家蠶（Bombyx mori）至少有2個(gè)亞型，植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）甚至存在十幾個(gè)亞型［9-10］。Ichimura 等［11］首次對(duì) 14-3-3 蛋白家族的作用進(jìn)行闡述，認(rèn)為該蛋白可作為絲氨酸/酪氨酸羥化酶的激活因子。真核生物中超過(guò)200種靶蛋白能與14-3-3蛋白發(fā)生相互作用，參與了細(xì)胞幾乎所有的重要生理過(guò)程，如新陳代謝，細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)節(jié)等［12］。由于14-3-3蛋白具備功能上的多樣性和在生物代謝過(guò)程中的重要性這兩個(gè)特性，使得該蛋白有可能作為分子藥物的靶標(biāo)，影響或調(diào)控生物體的某些生命過(guò)程［13］。

目前關(guān)于14-3-3蛋白基因的研究集中在人類臨床醫(yī)學(xué)［14-15］，對(duì)家蠶、果蠅、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）、柞蠶（Antheraea pernyi）、桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）等昆蟲(chóng)也有研究［10，16-19］，但對(duì)于鞘翅目昆蟲(chóng)未見(jiàn)報(bào)道。本研究從已經(jīng)構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)中篩選出含有14-3-3蛋白基因開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）的序列，通過(guò)Blast同源比對(duì)，鑒定為松墨天牛14-3-3ζ基因，并進(jìn)行該蛋白基因的生物信息學(xué)分析，初步探究14-3-3蛋白在松墨天牛發(fā)育代謝過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理、表達(dá)功能和設(shè)計(jì)以14-3-3蛋白為靶標(biāo)的昆蟲(chóng)行為調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

松墨天牛幼蟲(chóng)是從廣州從化區(qū)的一處馬尾松次生林采集而來(lái)，通過(guò)配置人工飼料的方式飼養(yǎng)至成蟲(chóng)［20］：每只蟲(chóng)單獨(dú)裝在50mL的塑料離心管中，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，飼養(yǎng)溫度為25～28℃，相對(duì)濕度為65%～75%，黑暗環(huán)境下生長(zhǎng)。

1.2 序列測(cè)定及鑒定

松墨天牛cDNA文庫(kù)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院昆蟲(chóng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其具體方法參照文獻(xiàn) ［21］。對(duì)松墨天牛cDNA文庫(kù)的陽(yáng)性克隆隨機(jī)測(cè)序獲得表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tags，EST），通過(guò)篩選文庫(kù)中的EST，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，得到一條與昆蟲(chóng)14-3-3 Zeta（ζ）同源的基因序列，該序列有完整的ORF。

1.3 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析（表1）。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

在NCBI （http：//www.Ncbi.nlm.Nih.gov/）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索昆蟲(chóng)14-3-3ζ氨基酸序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)；用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ法），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析用bootstrap進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列

通過(guò)在基因文庫(kù)中篩選和同源性比對(duì)，所克隆的基因鑒定為松墨天牛14-3-3ζ基因，命名為Ma14-3-3ζ，cDNA全長(zhǎng)為902 bp，其中包含15 bp 的5′端非編碼區(qū)以及140 bp的 3′端非編碼區(qū)，ORF從16～762 bp共747 bp，編碼248個(gè)氨基酸，推測(cè)的編碼蛋白分子量為28.16 ku，等電點(diǎn)為 4.73。Ma14-3-3ζ的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖1。

表1 生物信息學(xué)分析軟件及其功能

2.2 生物信息學(xué)分析

圖1 Ma14-3-3ζ基因全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列

Ma14-3-3ζ二級(jí)結(jié)構(gòu)包含了α-螺旋、β折疊和卷曲3種結(jié)構(gòu)（圖2）。在蛋白質(zhì)C末端和N末端各含有5個(gè)氨基酸位和16個(gè)氨基酸位的不規(guī)則卷曲，在該氨基酸中還含有2段β-折疊，分別占據(jù)8個(gè)氨基酸位和5個(gè)氨基酸位。在Ma14-3-3ζ二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占68.15%，β-折疊占5.24%，卷曲占26.61%。 Ma14-3-3ζ疏水性分析結(jié)果顯示為親水性蛋白。TMHMM軟件分析表明該蛋白為膜外蛋白，不存在跨膜區(qū)域。SignalP 分析沒(méi)有顯示該蛋白具有信號(hào)肽。卷曲螺旋是一種簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，它是由2 股或以上的α-螺旋相互纏繞形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，控制著蛋白質(zhì)寡聚化。通過(guò)COILS Server預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Ma14-3-3ζ一共有8個(gè)卷曲螺旋。通過(guò)SMART分析，結(jié)果表明：松墨天牛14-3-3ζ基因編碼蛋白有一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即14-3-3蛋白。

圖2 Ma14-3-3ζ的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 Ma14-3-3ζ與其他12種昆蟲(chóng)14-3-3ζ基因氨基酸序列比對(duì)

用DNAMAN軟件進(jìn)行Ma14-3-3ζ與大黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）等12種昆蟲(chóng)的14-3-3ζ氨基酸序列同源性比對(duì)（圖3）。Ma14-3-3ζ與12 種昆蟲(chóng)14-3-3ζ同源性為98%～90%，其中與大黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）的同源性達(dá)到了98%；與褐飛虱（Nilaparvata lugens）、蕪菁葉蜂（Athalia rosae）同源性為95%；與歐洲熊蜂（Bombus terrestris）同源性為94%；與阿根廷蟻（Linepithema humile）、玉帶鳳蝶 （Papiliopolytes）、佛羅里達(dá)弓背蟻（Camponotus floridanus）、棉鈴蟲(chóng)、家蠶等5種昆蟲(chóng)同源性為93%；與黑森癭蚊（Mayetiola destructor）、黑小按蚊（Anopheles atroparvus）、地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitata）等3種昆蟲(chóng)同源性為91%～90%。

由MEGA5.0軟件構(gòu)建的基于13種昆蟲(chóng)14-3-3ζ的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明：松墨天牛與大黃粉蟲(chóng)遺傳距離最近，在同一分枝上；與黑小按蚊等遺傳距離較遠(yuǎn)（圖4）。這些結(jié)果與序列同源性比對(duì)的結(jié)果相一致。

3 結(jié)論與討論

隨著基因組和功能基因組研究的迅猛發(fā)展，生物信息學(xué)的理論和方法也取得很大進(jìn)步，基于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和現(xiàn)代計(jì)算技術(shù)相結(jié)合的生物信息學(xué)分析技術(shù)，在昆蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［22］。本研究旨在從生物信息學(xué)角度初步研究松墨天牛表達(dá)的蛋白質(zhì)所具有的理化特性，為今后開(kāi)展松墨天牛14-3-3ζ基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

14-3-3蛋白具有高度保守性，是目前發(fā)現(xiàn)參與生命代謝途徑最多的蛋白之一，也是在臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域研究得比較多的蛋白之一［23-26］。14-3-3蛋白分子量在28～33 ku之間，等電點(diǎn)PI在4～5之間，無(wú)跨膜片段序列，能以同源/異源二聚體的形式與多種功能蛋白相互作用［27］。本研究通過(guò)對(duì)Ma14-3-3ζ的生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白含有248個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為28.16 ku，等電點(diǎn)PI為4.73，與前人所研究的14-3-3蛋白家族個(gè)體特征相吻合。而且Ma14-3-3ζ屬于膜外蛋白，不存在跨膜區(qū)域，通過(guò)同源比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，Ma14-3-3ζ與12種昆蟲(chóng)14-3-3ζ蛋白同源性高達(dá)90%以上，如此高的序列同源性也進(jìn)一步印證了14-3-3蛋白在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的高度保守。

Shandala等［28］發(fā)現(xiàn)果蠅 14-3-3ε 蛋白在果蠅先天性免疫以及抗菌肽的分泌中起著關(guān)鍵的作用；當(dāng)有外源物質(zhì)進(jìn)入果蠅和斑馬魚(yú)（Danio rerio）體內(nèi)時(shí)，14-3-3ζ蛋白可以調(diào)節(jié)絲切蛋白將異源物質(zhì)吞噬，從而提高了其對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）侵染的抵抗力，同樣家蠶中該蛋白的存在亦可增強(qiáng)家蠶對(duì)病毒的敏感性［29-30］。黃麟等［31］進(jìn)行了松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)（B. mucronatus）14-3-3蛋白基因全長(zhǎng)cDNA克隆與分析，發(fā)現(xiàn)兩者編碼氨基酸序列完全相同，并與植物線蟲(chóng)南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上最為親近。申建梅等［19］克隆了桔小實(shí)蠅14-3-3基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在桔小實(shí)蠅的不同組織不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，并推測(cè)可能在桔小實(shí)蠅蛹發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

松墨天牛是林業(yè)重大害蟲(chóng)，其整個(gè)生命周期需要經(jīng)過(guò)卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)這4次完全變態(tài)才能完成，該生命周期過(guò)程受到了大量細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的精確調(diào)控。14-3-3蛋白是目前發(fā)現(xiàn)參與代謝途徑、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、離子通道等生命過(guò)程最多的蛋白之一，因此對(duì)松墨天牛14-3-3蛋白的研究不僅有助于更好地闡明松墨天牛的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和生物機(jī)制，而且可以為新型昆蟲(chóng)調(diào)節(jié)劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。所以下一步研究重點(diǎn)將要探究Ma14-3-3ζ在松墨天牛體內(nèi)不同組織部位和發(fā)育階段的表達(dá)情況，以及在外源病毒入侵時(shí)該蛋白表達(dá)情況會(huì)發(fā)生怎樣的變化。這些都將有待利用RNA干擾、熒光定量表達(dá)等技術(shù)進(jìn)行更深入的研究。

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