楊正楠 廖良坤

摘 要 研究菠蘿皮渣發(fā)酵飼料的發(fā)酵特性及發(fā)酵對其營養(yǎng)的改善。對發(fā)酵過程中水分含量、可溶性固形物、酒精度和酸度的研究表明，菠蘿皮渣發(fā)酵飼料在發(fā)酵過程中水分含量和可溶性固形物分別升高2.7%和0.16 Brix°，發(fā)酵過程中酒精度和酸度均有較大幅度提升，分別提高了1.01%和0.94%。發(fā)酵后，飼料酸度和酒精度均為1.2%左右。對纖維素（中性洗滌纖維素和酸性洗滌纖維素）含量、粗蛋白含量、TCA蛋白含量和有機(jī)酸含量的研究，結(jié)果表明：發(fā)酵過程中纖維素含量降低，其中中性洗滌纖維素含量降低了8.3%，酸性洗滌纖維素含量降低了6.9%；粗蛋白含量由6.1%降低至5.4%，三氯乙酸（TCA）蛋白含量由0.54%提高至0.86%；乳酸含量急劇升高，其余有機(jī)酸基本維持穩(wěn)定。發(fā)酵過程提高了菠蘿皮渣的利用率，提升了營養(yǎng)價(jià)值。

關(guān)鍵詞 菠蘿皮渣 ；發(fā)酵 ；飼料 ；營養(yǎng)

中圖分類號 S816.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.002

Abstract The pineapple peel was fermented to prepare feed， and its fermenting features and nutrient improvement were analyzed. The moisture content， total soluble solids， alcohol and acidity of the pineapple peel fermented during the fermentation process were determined. The moisture content and soluble solids in the fermented feed were found to increase by 2.7% and 0.16 Brix° respectively during fermentation. After fermentation， the acidity and alcohol of the pineapple peel feed were about 1.2%. The analysis of cellulose （neutral detergent fiber and acid washing cellulose） content， crude protein content， Trichloroacetic acid （TCA） protein content and organic acid content of the feed showed that cellulose content during the fermentation was reduced， of which the neutral detergent fiber content was reduced by 8.3% and the acid washing cellulose content was reduced by 6.9%. The protein content was reduced from 6.1% to 5.4%. The TCA protein content was increased from 0.54% to 0.86%. The lactic acid content was dramatically increased while the rest of the organic acid content was stable. The fermentation process improved the utilization of pineapple peel residue and the nutritional value.

Keywords pineapple peel ； fermentation； feed ； nutrient

菠蘿是我國南方的重要水果，我國年產(chǎn)菠蘿超過30萬t，主要集中在廣東、海南、廣西等地。菠蘿因口感酸爽甜蜜、風(fēng)味良好而備受我國消費(fèi)者喜愛。近年來，我國菠蘿產(chǎn)量逐年遞增，為熱帶經(jīng)濟(jì)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。菠蘿在我國主要用于生產(chǎn)菠蘿罐頭和菠蘿果汁，加工過程中產(chǎn)生的菠蘿皮渣占菠蘿總重的40%。目前在工業(yè)生產(chǎn)中，除少部分皮渣直接用于飼料外，70%以上的殘?jiān)蝗拥?，造成資源的浪費(fèi)。發(fā)酵飼料是近年來新誕生的一類飼料。相較于傳統(tǒng)飼料，發(fā)酵飼料具有提升動(dòng)物免疫水平，改善肉品質(zhì)，預(yù)防疾病等多種功效[1]。同時(shí)，發(fā)酵飼料中含有豐富的細(xì)菌素等多肽，具有廣譜抗菌功效，能有效的替代抗生素，對解決抗生素的濫用具有重要作用[2-3]。本文利用發(fā)酵方法研究菠蘿皮渣飼料的發(fā)酵過程，揭示其發(fā)酵特性，并研究發(fā)酵過程對菠蘿皮渣營養(yǎng)的改善。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑材料

發(fā)酵劑：枯草芽孢桿菌，植物乳桿菌，假絲酵母菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；菠蘿皮渣，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.99%），sigma公司；福林酚試劑，3%十二烷基磺酸鈉，2%十六烷三甲基溴化銨，乙二胺四乙酸鈉，四硼酸鈉，乙二醇乙醚，無水磷酸氫二鈉，硫酸，無水亞硫酸鈉，丙酮，十氫化萘等。

1.1.2 設(shè)備

烘箱，糖度計(jì)，pH計(jì)，高效液相色譜儀，紫外分光光度計(jì)，凱氏定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 菠蘿皮渣飼料發(fā)酵

菠蘿榨汁后，立即收集皮渣，并按萬分之一的量混入發(fā)酵劑，發(fā)酵劑采用冷凍干燥法制備，即將3種菌培養(yǎng)至對數(shù)末期，將3種培養(yǎng)基等體積混合后，離心收集菌泥，利用10%滅菌脫脂乳重懸后，進(jìn)行冷凍干燥，即得到混合菌泥。接入菌劑后充分混勻，裝袋密封，于37℃下恒溫培養(yǎng)，每隔4 h取一小袋放入-20℃，備用，共發(fā)酵60 h。

1.2.2 菠蘿皮渣水分及可溶性固形物測定

菠蘿皮渣水分含量利用烘干法測定：稱取5 g菠蘿皮渣于干燥稱量瓶中，置于105℃烘箱中2 h左右，取出放入干燥器內(nèi)，冷卻后用分析天平稱量。復(fù)烘至恒重（二次稱重相差不超過0.002 g即為恒重），計(jì)算水分含量?？扇苄怨绦挝餃y量：取菠蘿皮渣適量并加入等量的去離子水磨漿，超聲30 min，取上清液，利用糖度計(jì)測量可溶性固形物，并計(jì)算皮渣的糖度。

1.2.3 酸度、酒精度測定

酸度測定采用國標(biāo)GB/T 12456-2008方法測定；酒精度測定采用國標(biāo)GB 5009.225-2016密度法測定。

1.2.4 中性纖維素與酸性纖維素測定[4]

（1） 中性滌纖維素（NDF）測定：稱取風(fēng)干發(fā)酵飼料1.0 g，置于燒杯中，加入中型洗滌劑100 mL和數(shù)滴十氫化萘以及0.5 g無水亞硫酸鈉，煮沸1 h，冷卻10 min，將殘?jiān)迫氤闉V瓶，沖洗抽濾，直至濾液呈中性為止，用20 mL丙酮沖洗殘?jiān)?次，直至丙酮為無色，將濾膜上的殘?jiān)迫脎釄澹?00℃烘干3 h，至恒重，稱取殘?jiān)亓考礊镹DF的含量。

（2） 酸性洗滌纖維素（ADF）測定：稱取風(fēng)干發(fā)酵飼料1.0 g，加入酸性洗滌劑100 mL和數(shù)滴十氫化萘，洗滌方式同NDF測定，洗滌后收集殘?jiān)娓芍梁阒?，稱取殘?jiān)亓考礊锳DF的含量。

1.2.5 粗蛋白含量測定

按照GB 50095-2010凱氏定氮法測定。

1.2.6 TCA可溶解蛋白測定

三氯乙酸（TCA）可溶解蛋白為肽鏈小于10個(gè)氨基酸的多肽及游離氨基酸，TCA可溶解蛋白的測定在氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度的基礎(chǔ)上進(jìn)行，按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19541-2004方法獲得上清液，向上清液中加入10%TCA溶液，靜置離心后取上清，通過茚三酮比色，測定上清液中游離氨基的含量。具體步驟如下：（1）稱取發(fā)酵飼料試樣1.0 g，加入氫氧化鉀溶液，磁力攪拌20 min，3 000 r/min離心10 min，小心移取上清液。（2）上清液中加入等量10% TCA溶液，混合后靜置10 min，3 000 r/min離心20 min，取上清。（3）0.5 mL上清液中加入1.5 mL梓檬酸納緩沖液，再加入茚三酮溶液1.5 mL，沸水浴15 min，冷卻至室溫，于吸光度570 nm測定吸光度。（4）將亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.012 5、0.025、0.05和0.1 mmol/L，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.2.7 有機(jī)酸含量測定

將發(fā)酵飼料樣品稀釋10倍，離心收集上清液，用0.22 μm水系膜過濾后，利用高效液相色譜（HPLC）檢測發(fā)酵飼料有機(jī)酸含量。檢測條件：流動(dòng)相為1%磷酸水溶液，等度洗脫，流速為0.5 mL/min，有機(jī)酸柱，柱溫箱40 ℃，紫外檢測器，檢測波長為205 nm。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和Spss對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Origin對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果表示為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

2 結(jié)果及分析

2.1 水分及可溶性固形物含量變化

酵母菌在有氧情況下，發(fā)酵產(chǎn)生水分和CO2，在無氧環(huán)境下，產(chǎn)生酒精。芽孢桿菌是需氧發(fā)酵菌，代謝產(chǎn)生乳酸和各類酶。植物乳桿菌為兼性厭氧菌，代謝產(chǎn)生乳酸。由菠蘿皮渣發(fā)酵過程中物料水分含量和可溶性固形物含量變化（圖1）可知，發(fā)酵初始階段（t<12 h），物料水分略有上升，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵初始階段，物料中含有氧氣，酵母進(jìn)行有氧發(fā)酵產(chǎn)生了水分，當(dāng)發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行，物料水分含量基本維持穩(wěn)定，主要是經(jīng)過酵母和芽孢桿菌的有氧發(fā)酵，物料中處于缺氧環(huán)境，主要進(jìn)行厭氧發(fā)酵，此時(shí)主要是酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精，植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。發(fā)酵過程中，物料可溶性固形物先降低后升高，一方面是由于物料開始階段水分含量升高，另一方面，由于發(fā)酵過程消耗糖，產(chǎn)生CO2，導(dǎo)致體系可溶性固形物降低；但發(fā)酵中后期，物料可溶性固形物逐漸升高，這是由于發(fā)酵過程是不溶性物質(zhì)如纖維素、蛋白質(zhì)等降解為可溶性物質(zhì)[6]。

2.2 酸度及酒精度變化

酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生水分和酒精，增加飼料的風(fēng)味，而植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，增加飼料的酸度。由菠蘿皮渣飼料發(fā)酵過程中酸度和酒精度的變化（圖2）可知，酒精度在發(fā)酵前期處于非常低的水平，在20 h以后，含量逐漸升高，主要是由于酵母在前期進(jìn)行有氧發(fā)酵，產(chǎn)生水和CO2，待物料中氧氣含量較低時(shí)，才開始進(jìn)行酒精發(fā)酵。而飼料的酸度從發(fā)酵開始逐漸升高，這是由于開始階段，枯草芽孢桿菌生長較快，產(chǎn)生乳酸，發(fā)酵后期，氧氣逐漸降低，枯草芽孢桿菌發(fā)酵減慢，主要是因?yàn)橹参锶闂U菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸[7]。

2.3 NDF和ADF含量變化

飼料發(fā)酵能提高飼料的利用率，主要是能將飼料中不可利用的部分如半纖維素、纖維素等降解為可以消化利用的部分[8-9]。由菠蘿皮渣發(fā)酵過程中NDF和ADF含量變化（圖3）可知，菠蘿皮渣中中性洗滌纖維素含量高于酸性洗滌纖維素，并且在整個(gè)發(fā)酵過程中，二者含量均逐漸降低，中性洗滌纖維素含量降低了8.3%，酸性洗滌纖維素含量降低了6.9%，說明飼料中不可利用的部分逐漸降低，發(fā)酵過程提高了飼料的利用率。

2.4 粗蛋白含量變化

飼料發(fā)酵過程中，代謝除產(chǎn)生CO2、酒精、乳酸外，隨著發(fā)酵環(huán)境的改變，次級代謝產(chǎn)物如蛋白酶、糖化酶、多肽等會不斷積累[10]。粗蛋白中，有部分不可被動(dòng)物體吸收，通過發(fā)酵后，粗蛋白會被降解為多肽或氨基酸[11]。由菠蘿皮渣發(fā)酵過程中粗蛋白含量的變化（圖4）可知，粗蛋白含量在發(fā)酵后期逐漸降低，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期發(fā)酵菌株尤其是枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生了蛋白酶，將粗蛋白逐漸分解，發(fā)酵結(jié)束后，粗蛋白含量由6.1%降低至5.4%。

2.5 TCA蛋白變化

TCA可溶解蛋白為肽鏈小于10個(gè)氨基酸的多肽及游離氨基酸，是飼料發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的一類主要營養(yǎng)因子，具有抗菌和提高動(dòng)物體免疫的作用[12-13]。由菠蘿皮渣發(fā)酵過程中TCA蛋白含量的變化（圖5）可見，發(fā)酵24 h后，TCA含量逐漸升高，這與粗蛋白含量變化相對應(yīng)，說明發(fā)酵過程能將粗蛋白分解為可以利用的氨基酸和多肽，菠蘿皮渣發(fā)酵后，TCA蛋白含量由0.54%提高至0.86%，提高了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。

2.6 有機(jī)酸變化

有機(jī)酸是枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵代謝的主要初級代謝產(chǎn)物，具有抑制致病菌生長的功效[14]。由菠蘿皮渣發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化（圖6）可知，菠蘿中檸檬酸和蘋果酸含量較高，檸檬酸含量為3.47 mg/g，蘋果酸含量為1.05 mg/g，乳酸、酒石酸、乙酸含量非常低。發(fā)酵后，飼料中乳酸含量急劇升高，而其余有機(jī)酸基本維持穩(wěn)定，主要是由于枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，發(fā)酵50 h后，乳酸含量維持在9.4 mg/g左右維持穩(wěn)定，說明50 h后，發(fā)酵基本結(jié)束。

3 結(jié)論

本文利用復(fù)合發(fā)酵菌種枯草芽孢桿菌、假絲酵母菌、植物乳桿菌對菠蘿皮渣進(jìn)行飼料發(fā)酵，研究菠蘿皮渣發(fā)酵飼料的發(fā)酵特性及發(fā)酵對其營養(yǎng)的改善。通過對發(fā)酵過程中發(fā)酵特性的研究，表明利用復(fù)合菌發(fā)酵后，菠蘿皮渣發(fā)酵飼料的水分含量和可溶性固形物略有升高，酒精度和酸度有較大幅度提升，發(fā)酵飼料的酸度和酒精度均為1.2%左右。通過對中性洗滌纖維素和酸性洗滌纖維素含量、粗蛋白含量、TCA蛋白含量、有機(jī)酸含量等營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中纖維素含量降低，其中中性洗滌纖維素含量降低8.3%，酸性洗滌纖維素含量降低6.9%。粗蛋白含量由6.1%降低至5.4%，TCA蛋白含量0.54%提高至0.86%，有機(jī)酸總量有大幅度提升，主要是乳酸含量急劇升高。研究表明，利用本復(fù)合發(fā)酵菌發(fā)酵后，提高了菠蘿皮渣的利用率，提升了營養(yǎng)價(jià)值。本研究將為菠蘿等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的飼料發(fā)酵提供技術(shù)和理論指導(dǎo)。

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