陳 英，喬 軍，孟慶玲*，鐘文強(qiáng)，劉田莉，貢莎莎，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

細(xì)粒棘球蚴病俗稱包蟲病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg)中絳期幼蟲寄生于人、畜臟器內(nèi)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。綿羊是Eg最適宜的中間宿主，發(fā)病后使羊發(fā)育不良，生長(zhǎng)緩慢，給畜牧業(yè)造成較重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。該病呈世界性分布，在我國(guó)許多牧區(qū)廣泛流行。新疆是我國(guó)五大牧區(qū)之一，是受該病流行最為嚴(yán)重的地區(qū)之一，北疆綿羊的平均感染率為61.2%，南疆地區(qū)綿羊平均感染率為 38.9%[3，5]，尤其牧場(chǎng)放牧的綿羊感染率較高。

目前，細(xì)粒棘球蚴病的血清學(xué)診斷仍然存在特異性較低、敏感性不高等問題[6-7]。因此，篩選具有強(qiáng)特異性和反應(yīng)原性的抗原蛋白是克服現(xiàn)有血清學(xué)診斷缺點(diǎn)的前提。盡管現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了囊液、粗提原頭節(jié)蛋白、EgAgB、抗原5、EG95等Eg抗原蛋白[8-12]，然而囊液、粗提原頭節(jié)抗原雖然敏感性較高，但特異性較差，與多房棘球絳蟲、豬帶絳蟲發(fā)生交叉反應(yīng)[13-14]；EgAgB、抗原5和Eg95等抗原雖然特異性較高，但敏感性較差，給確診帶來(lái)困難[15-17]。因此候選基因的篩選與獲得顯得尤為重要。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶mu 2(Glutathione s-transferase mu 2, GST-mu2)參與宿主--寄生蟲之間的相互作用，并對(duì)細(xì)胞的黏附、信號(hào)的傳導(dǎo)、移動(dòng)以及侵襲等生命活動(dòng)有重要的影響，同時(shí)也與免疫逃避密切相關(guān)[18]。本試驗(yàn)旨在通過篩選、克隆Eg GST-mu2蛋白基因, 對(duì)其重要功能位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域和抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并將該基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，通過Western blot鑒定表達(dá)的pET-GST-mu2重組蛋白能否與Eg陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，從而分析其是否具有反應(yīng)原性，為進(jìn)一步利用GST-mu2蛋白作為Eg感染診斷的候選抗原奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

Eg病料組織采自新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病防控中心綿羊的肝臟，標(biāo)本采集后立即凍存于-80 ℃冰箱保存。pET-28a菌種、菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存；組織RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑、DNA Marker、pMD19-T載體、T4 DNA 連接酶、內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindIII、蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。Eg綿羊陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)所提供；HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG、cECL Western Blot Kit購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 總RNA的提取

從新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病防控中心采集感染Eg綿羊的肝臟，將囊液抽取于1.5 mL的EP管內(nèi)，12 000 rpm離心10 min，將離心后的上清液置于-20 ℃保存，將含有原頭蚴的樣本用TaKaRa公司的組織 RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3 Eg GST-mu2引物的設(shè)計(jì)與合成

1.4 Eg GST-mu2的RT-PCR擴(kuò)增、克隆

采用20 μL反應(yīng)體系：H2O210 μL，PCR Mixture 7 μL，提取的cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Eg GST-mu2基因擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40s，72 ℃延伸55 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；將RT-PCR產(chǎn)物在1.0 %的瓊脂糖凝膠上跑電泳，并對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化回收。

1.5 目的基因的序列測(cè)定及分析

將回收的EgGST-mu2基因片段與pMD19-T載體4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性平板篩選后挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和EcoR I、Hind III雙酶切鑒定后，送往北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。利用生物學(xué)在線分析軟件將測(cè)序結(jié)果用在線軟件MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測(cè)蛋白的糖基化位點(diǎn)、磷酸化等修飾位點(diǎn)。TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。通過DNASTAR (Jameson Wolf方法)對(duì)Eg GST-mu2蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過DNAMAN軟件對(duì)不同物種間的GST氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析。

1.6 原核表達(dá)質(zhì)粒Eg GST-mu2的構(gòu)建

將pMD-GST-mu2質(zhì)粒與pET-28a原核表達(dá)載體用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI 和Hind III于37 ℃進(jìn)行雙酶切。分別回收目的基因EgGST-mu2片段和載體片段，在T4 DNA 連接酶作用下4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在Kana抗性平板37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，再經(jīng)PCR和雙酶切方法篩選重組質(zhì)粒pET-GST-mu2。

1.7 重組蛋白Eg GST-mu2的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-GST-mu2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Kana抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，吸取300 μL菌液接種到Kana抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6～0.8，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.8 重組蛋白 GST-mu2的SDS-PAGE和Western blot鑒定分析

分別誘導(dǎo)0 h、4 h、6 h、8 h后收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。離心收集300 mL菌液，加8 mL的Lysis Buffer 裂解菌體，經(jīng)反復(fù)凍融3～4次后，超聲破碎1 h，直至菌體呈現(xiàn)清亮為止；將菌體于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，分別取沉淀與上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，從而進(jìn)行目的蛋白的可溶性分析。選擇重組菌表達(dá)量最高時(shí)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以綿羊細(xì)粒棘球蚴陽(yáng)性血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG為二抗，分析Eg重組蛋白pET-GST-mu2的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eg GST-mu2基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測(cè)得到660 bp的目的條帶，與GenBank中提供的EgGST-mu2基因片段大小一致(圖1)。對(duì)陽(yáng)性克隆pD-GST-mu2菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果可擴(kuò)增得到GST-mu2大小一致的基因片段。

圖1 Eg GST-mu2基因 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1-3: RT- PCR產(chǎn)物Fig.1 Amplification of Eg GST- mu2 gene by RT- PCRM: DL-2000 DNA Marker; 1-3: RT-PCR amplified product

2.2 Eg GST-mu2基因的序列測(cè)定及分析

經(jīng)測(cè)序，該基因開放閱讀框?yàn)?60 bp，編碼219個(gè)氨基酸。經(jīng)DNAMAN軟件分析顯示，與GenBank中檢索的EgGST-mu2基因序列同源性為99.85%，僅在第454個(gè)堿基處由A變?yōu)镚，對(duì)應(yīng)的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有2個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N端?；稽c(diǎn)， 3個(gè)CKⅡ磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)TYR磷酸化位點(diǎn)，通過在線軟件TMHMM Server v.2.0分析無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；抗原表位集中區(qū)在28-70、147-219位(圖2)。

與其它寄生蟲的GST氨基酸序列的同源性和遺傳進(jìn)化分析顯示，EgGST與豬帶絳蟲GST(TaeniasoliumGST，TaesolGST)同源性為85%，與多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，EmGST)同源性為76%，EgGST與微口膜殼絳蟲(Hymenolepismicrostoma，HymemicGST)同源性為67%，與猬迭宮絳蟲(Spirometraerinaceieuropaei，SpierinGST1)的同源性高于50%(圖3、4)。

圖2 Eg GST-mu2 cDNA的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列引物序列(下劃線)；N端?；稽c(diǎn)(斜體)；CKⅡ磷酸化位點(diǎn)(陰影部分)；PKC磷酸化位點(diǎn)(虛線)TYR磷酸化位點(diǎn)(波浪線)；抗原表位集中區(qū)(方框)Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Eg GST-mu2 cDNAPrimer sequence (underlined); N-terminal acylation site (red); CKⅡphosphorylation site (shade); PKC phosphorylationsite (imaginary line); TYR phosphorylation site (wave); Epitope concentration region (square frame)

圖3 不同寄生蟲間GST蛋白的氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of amino acid of GST protein among different parasites

圖4 幾種代表性的蠕蟲GST蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of several representativeworm based on GST gene

2.3 pET-GST-mu2重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

用EcoRI和HindIII分別對(duì)pD-GST-mu2和pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并回收目的基因片段和pET-28a 載體片段，將兩個(gè)片段用T4 DNA 連接酶過夜連接后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR可擴(kuò)增出目的基因片段(圖5)。用EcoR I/Hind III雙酶切得到660 bp的目的條帶和5 369 bp的pET-28a片段(圖6)，表明成功構(gòu)建了pET-GST-mu2重組原核表達(dá)載體。

圖5 pET-GST-mu2 載體PCR鑒定M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1-4. 菌液PCR產(chǎn)物Fig.5 Identification of pET-GST-mu2 by PCRM. DNA molecular quality standard;1-4. The bacterialPCR products

圖6 pET-GST-mu2雙酶切鑒定結(jié)果M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 雙酶切對(duì)照;2-3. pET-GST-mu2雙酶切產(chǎn)物Fig.6 Double enzyme digestion results of pET-GST-mu2M.DL-5000 DNA Marker; 1. Double enzyme digestion control;2-3. The products of pET-GST-mu2 by double enzyme digestion

2.4 重組蛋白GST-mu2在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE與Western blot分析

將鑒定正確的pET-GST- mu2轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)0 h、4 h、6 h、8 h后，SDS-PAGE電泳分析顯示，在約32 kDa處出現(xiàn)融合蛋白帶，其中8 h時(shí)表達(dá)量最高(圖7)。Western blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約32 kDa處可見特異反應(yīng)條帶，表達(dá)的重組蛋白GST-mu2能與綿羊Eg陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，提示重組蛋白GST-mu2具有較好反應(yīng)原性(圖7)。

圖7 重組蛋白GST-mu2 SDS-PAGE及Western blot分析M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET- GST- mu2菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)產(chǎn)物；2. pET- GST- mu2菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物；3. pET- GST- mu2菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h表達(dá)產(chǎn)物；4. pET-28a菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h表達(dá)產(chǎn)物；5. pET- GST- mu2菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0 h表達(dá)產(chǎn)物;6-7. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白Fig.7 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein GST-mu2M. Protein molecular quality standand;1. Expression product of pET-GST-mu2 after inducing 4 h with IPTG;2. Expression product of pET-GST-mu2 after inducing 6 h with IPTG;3. Expression product of pET-GST-mu2after inducing 8 h with IPTG;4. Expression product of pET-28a after inducing 8 h with IPTG;5. Expression productof pET-GST-mu2 after inducing 0 with IPTG;6-7. Recombined protein induced by IPTG.

3 討 論

GST-mu2廣泛存在于動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌等生物體內(nèi)，是由多個(gè)基因編碼、具有多種功能的超家族酶[19]。它能夠使毒素分子失活從而轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄曰衔?，因此是多?shù)生物體內(nèi)重要的解毒系統(tǒng)[18]。此外，在寄生蟲研究中還發(fā)現(xiàn)GST-mu2可作為強(qiáng)保護(hù)性抗原、能有效降低機(jī)體蟲荷與排泄物蟲卵數(shù)量及影響成蟲生殖的能力[19]。

至今已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定的具有診斷價(jià)值的Eg抗原蛋白主要包括囊液抗原、粗提原頭節(jié)蛋白抗原、Eg95、EgAgB和抗原5等，其中囊液抗原(HCF)被認(rèn)為是診斷包蟲病的主要抗原，Zheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，囊液抗原的敏感性為75%～95%，但其特異性不高，可與其他絳蟲病(例如多房棘球絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲)、線蟲病或吸蟲病血清發(fā)生交叉反應(yīng)[13]，從而影響到實(shí)際診斷的準(zhǔn)確性。然而，抗原5、Eg95、EgAgB、抗原特異性雖然高，但其敏感性較差，難以確診[5，11，17]。因此篩選具有一定診斷意義的抗原顯得尤為重要。GST目前已被廣泛用作寄生蟲感染的最佳候選疫苗，且已有相關(guān)研究表明瘧原蟲、肝片吸蟲、血吸蟲及豬帶絳蟲等它們的GST-mu2具備較好的抗原性與免疫原性，是WHO提出的6個(gè)最具有潛力的候選疫苗分子之一[18]。但是關(guān)于細(xì)粒棘球蚴絳蟲的GST-mu2的研究至今未見詳細(xì)報(bào)道。在對(duì)寄生蟲的研究中還發(fā)現(xiàn)，GST-mu2還參與細(xì)胞的抗氧化和自由基的抗損害作用，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)控功能，在逃避宿主免疫反應(yīng)過程中扮演著極其重要的角色[19]。此外，該酶與宿主與人之間其基因結(jié)構(gòu)與功能方面還存在著一定的差異，這也是它能作為藥物靶標(biāo)、診斷抗原或候選疫苗分子的基礎(chǔ)[19-20]。戴佳琳等對(duì)豬帶絳蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST-mu2進(jìn)行了原核表達(dá)及免疫學(xué)研究，結(jié)果表達(dá)的重組蛋白可被感染豬帶絳蟲的病人及豬血清所特異性識(shí)別[18]。且姜片吸蟲和曼氏血吸蟲的GST-mu2重組疫苗已被證實(shí)，對(duì)牛、羊都具有較好的抗體反應(yīng)與較強(qiáng)的抗感染作用[18]。因此，在細(xì)粒棘球蚴的研究中GST-mu2蛋白有望作為很好的候選診斷抗原分子。

為了篩選和鑒定反應(yīng)原性強(qiáng)的Eg診斷抗原，本研究通過對(duì)EgGST-mu2基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆，測(cè)序后對(duì)其重要功能位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域以及抗原表位進(jìn)行分析，并亞克隆至表達(dá)載體pET-28a中，成功構(gòu)建pET-GST-mu2原核表達(dá)載體。然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，通過IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測(cè)到約31 kDa的蛋白特異性條帶。Western blot鑒定顯示，GST-mu2重組蛋白能特異性識(shí)別Eg陽(yáng)性血清，證實(shí)此蛋白具有較好的反應(yīng)原性，具有作為Eg診斷候選抗原的潛在價(jià)值。

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