李 賀，李 寧，劉 聰，劉佳樂，王夢(mèng)陽，莊文越，王春梅，孫靖輝，陳建光

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，吉林 吉林 132013； 2.吉林省吉林市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 吉林 132001)

焦慮癥又稱為焦慮性神經(jīng)癥，是最常見的精神障礙之一，其發(fā)病率逐年增高[1-4]。研發(fā)具有抗焦慮功能的藥物及保健食品意義重大。五味子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，應(yīng)用歷史悠久。本課題組前期研究[5]顯示：五味子木脂素具有顯著的抗焦慮作用，但其主要活性成分尚不清楚。五味子乙素(schisandrin B，SchB)是五味子木脂素的主要活性成分之一，目前尚無SchB抗焦慮作用的相關(guān)報(bào)道。本研究通過高架十字迷宮和高架零迷宮觀察SchB的抗焦慮作用，并通過檢測(cè)小鼠外周血和腦組織中γ-氨基丁酸 (GABA)和谷氨酸(Glu)水平以及腦組織中GABAA受體α1亞單位(GABAARα1)及GABAA受體γ2亞單位(GABAARγ2)蛋白的表達(dá)水平探討其相關(guān)機(jī)制，以期為開發(fā)抗焦慮藥物及保健食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑清潔級(jí)ICR雄性小白鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(吉)2016-0005。小鼠采取分籠飼養(yǎng)，且維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，飼料供給充足，自由飲水。SchB(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，生理鹽水(黑龍江科倫制藥有限公司)，GABA和Glu的ELISA試劑盒(美國(guó)分裝GBD公司)。

1.2 主要儀器和設(shè)備JA精密電子天平和電熱恒溫水浴鍋均購(gòu)于沈陽市科瑞儀器公司，KQ-50DA超聲清洗機(jī)購(gòu)于江蘇省昆山市超聲儀器公司，TM-Vision小鼠行為學(xué)儀器購(gòu)于成都市泰盟科技公司，F(xiàn)SH-2型高速勻漿機(jī)購(gòu)于江蘇省金壇億通電子有限公司，LD5-10B高速離心機(jī)購(gòu)于北京市離心機(jī)廠，生化培養(yǎng)箱(BSP-250)購(gòu)于上海市博迅公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀 購(gòu)于瑞士TECAN集團(tuán)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、2.5 mg·kg-1SchB組、5.0 mg·kg-1SchB組和10.0 mg·kg-1SchB組，每組10只。各給藥組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量SchB，空白對(duì)照組小鼠給予相同容積蒸餾水，每天1次，容量均為0.1 mL·10 g-1，連續(xù)給藥7 d，于末次給藥后40 min分別進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)和Western blotting 法檢測(cè)。

1.4 小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從籠中取出(動(dòng)物背向?qū)嶒?yàn)者)，放置在開臂與閉臂結(jié)合的中央?yún)^(qū)域。實(shí)驗(yàn)者迅速安靜離開，開啟攝像監(jiān)控器，記錄5 min內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入開臂次數(shù)，計(jì)算開臂進(jìn)入次數(shù)百分率[開臂進(jìn)入次數(shù)/(開臂+閉臂總次數(shù))]和開臂滯留時(shí)間百分率[開臂滯留時(shí)間/(開臂+閉臂總時(shí)間)]。

1.5 小鼠高架零迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠高架零迷宮實(shí)驗(yàn)原理與高架十字迷宮相同，是由高架十字迷宮發(fā)展而來的既傳統(tǒng)又新穎的動(dòng)物行為學(xué)系統(tǒng)。高架零迷宮包括一個(gè)圓形平臺(tái)、兩個(gè)相對(duì)開放、兩個(gè)相對(duì)封閉的象限，開放象限和封閉象限區(qū)分明顯，去除了高架十字迷宮中間的模糊區(qū)域，并可以不間斷地探測(cè)。測(cè)量的主要參數(shù)有平臺(tái)邊緣探頭次數(shù)百分率、進(jìn)入開臂的次數(shù)百分率和開臂探頭次數(shù)百分率等。本研究是通過高架零迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SchB的抗焦慮作用。

1.6 小鼠外周血和腦組織中GABA和Glu水平的檢測(cè)小鼠于第7天灌胃給藥40 min后斷頭取血，將新鮮血液放至高速離心機(jī)中， 4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取外周血清；迅速在冰墊上分離出腦組織，用0.9%生理鹽水沖去血水，用濾紙吸干多余水分。以組織質(zhì)量∶生理鹽水為1∶9的比例，將其制成濃度為10%的組織上清液。取外周血和腦組織上清液，分別采用ELISA法檢測(cè)GABA及Glu水平(詳見試劑盒說明書)，并計(jì)算GABA/Glu的比值。

1.7 Western blotting法檢測(cè)小鼠腦組織中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表達(dá)水平小鼠于第7天灌胃給藥40 min后，每組取3 只小鼠腦組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，入高速離心機(jī)離心取上清。采用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白。2 h電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，取出膜在Tris緩沖液(TBST)中漂洗5 min，然后用封閉液 (含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉1 h。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入GABAA Rα1和GABAA Rγ2一抗(1∶1 000)，4℃溫育過夜后，TBST洗5×5 min。加入二抗(1∶2 000)溫育2 h，TBS-T洗5×5 min，最后加入顯色液ECL顯色。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)通過灰度值計(jì)算其蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次給藥后40 min進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。與空白對(duì)照組比較，5.0 和10.0 mg·kg-1SchB組小鼠開臂滯留時(shí)間百分率及開臂進(jìn)入次數(shù)百分率均明顯升高(P< 0.05或P< 0.01)。見表1。

2.2 各組小鼠高架零迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次給藥后40 min進(jìn)行高架零迷宮實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用開臂進(jìn)入次數(shù)百分率及開臂探頭次數(shù)百分率評(píng)價(jià)小鼠的焦慮程度。與空白對(duì)照組比較，5.0 和10.0 mg·kg-1SchB組小鼠開臂探頭次數(shù)百分率和開臂進(jìn)入次數(shù)百分率均明顯增加(P< 0.01)。見表2。

表1 各組小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中開臂滯留時(shí)間百分率(OT%)和開臂進(jìn)入次數(shù)百分率(OE%)

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group.

表2 各組小鼠高架零迷宮實(shí)驗(yàn)中開臂進(jìn)入次數(shù)百分率(OE%)和開臂探頭次數(shù)百分率(OP%)

*P<0.01 compared with blank control group.

2.3 各組小鼠外周血和腦組織中GABA和Glu水平與空白對(duì)照組比較，10.0 mg·kg-1SchB組小鼠外周血和腦組織中GABA水平明顯增加(P< 0.01)，Glu水平明顯降低(P< 0.01)，GABA/Glu比值明顯升高(P< 0.01)。見表3。

2.4 各組小鼠腦組織中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，10.0 mg·kg-1SchB組小鼠腦組織中GABAARα1和GABAARγ2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。見圖1。

3 討 論

SchB為五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素。大量研究[6-8]表明：SchB 具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多種藥理作用，但目前尚未見其抗焦慮作用的相關(guān)報(bào)道。本研究通過高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和零迷宮實(shí)驗(yàn)，采用開臂探頭次數(shù)百分率、開臂進(jìn)入次數(shù)百分率和開臂探頭次數(shù)百分率等指標(biāo)來觀察SchB的抗焦慮作用。開臂探頭次數(shù)百分率、開臂進(jìn)入次數(shù)百分率及開臂探頭次數(shù)百分率越高，表明受試小鼠焦慮程度越低[1-3,9]。本研究結(jié)果顯示：在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，中和高劑量SchB組小鼠開臂滯留時(shí)間百分率及開臂進(jìn)入次數(shù)百分率較空白對(duì)照組均明顯增高；在零迷宮實(shí)驗(yàn)中，中和高劑量SchB組小鼠開臂探頭次數(shù)百分率及開臂進(jìn)入次數(shù)百分率較空白對(duì)照組均明顯增加。提示SchB對(duì)受試小鼠具有抗焦慮作用。在上述2個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，低劑量SchB組小鼠各指標(biāo)均未見明顯變化，中和高劑量SchB組之間比較也無明顯變化，提示SchB的抗焦慮作用的劑量效應(yīng)關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

表3 各組小鼠外周血和腦組織中GABA和Glu水平及GABA/Glu比值

Tab.3 Levels of GABA and Glu in peripheral blood and brain tissue and radios of GABA/Glu of mice in various groups

表3 各組小鼠外周血和腦組織中GABA和Glu水平及GABA/Glu比值

GroupGABA[wB/(ng·mg-1)]BloodBrainGlu[wB/(ng·mg-1)]BloodBrainGABA/GluBloodBrainBlankcontrol59．83±5．3345．87±5．9564．87±7．7255．87±5．950．93±0．110．81±0．0210．0mg·kg-1SchB74．14±9．14?56．00±1．87?51．14±3．97?47．67±1．47?1．46±0．27?1．17±0．01?

*P<0.01 compared with blank control group.

Lane 1:Blank control group; Lane 2:10.0 mg·kg-1 SchB group. n=3;*P<0.01 compared with blank control group.

Glu是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的具有興奮作用的神經(jīng)遞質(zhì)， GABA是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的具有抑制作用的神經(jīng)遞質(zhì)。研究[10-12]顯示：當(dāng)焦慮發(fā)生時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)Glu水平升高，GABA 及GABA/Glu比值降低。GABA與Glu比例的平衡與焦慮癥的發(fā)生密切相關(guān)。本研究選取高劑量SchB組小鼠觀察SchB對(duì)GABA和Glu水平的影響，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，SchB給藥組小鼠外周血及腦組織中Glu水平降低， GABA 水平升高，GABA/Glu比值升高，提示SchB對(duì)小鼠的抗焦慮作用與其調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)Glu、GABA 水平及GABA/Glu比值有關(guān)。

GABA的生理功能主要通過其與GABA受體特異性結(jié)合而產(chǎn)生。GABAA受體(GABAAR)是介導(dǎo)抗焦慮效應(yīng)的主要功能受體。GABA 作用于GABAAR上，使神經(jīng)細(xì)胞膜的Cl-離子通透性增加，細(xì)胞內(nèi)離子濃度低于細(xì)胞外，使Cl-離子順濃度差進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜內(nèi)的負(fù)電位進(jìn)一步增加，細(xì)胞由極化變?yōu)槌瑯O化，進(jìn)而發(fā)生抑制效應(yīng)，從而表現(xiàn)為抗焦慮作用。在成熟腦中，GABAARα1與GABAARγ2亞單位的組合在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，是GABAAR的重要功能基團(tuán)，GABAARα1和GABAARγ2 表達(dá)下調(diào)，與焦慮的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)[13-17]。本研究結(jié)果顯示：SchB能夠明顯增加小鼠腦組織中GABAARα1和GABAARγ2蛋白的表達(dá)水平，提示SchB對(duì)小鼠的抗焦慮作用與其上調(diào)GABAARα1與GABAARγ2蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，SchB 對(duì)小鼠具有抗焦慮作用，該作用可能與調(diào)節(jié)小鼠外周血和腦組織中的GABA、Glu水平和GABA/Glu比值及腦組織中的GABAARα1和GABAARγ2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。本研究為開發(fā)抗焦慮藥物及保健食品提供了理論依據(jù)。

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