朱 剛,孫海斌，徐 剛

( 1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨外科， 河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院病理科， 河南 鄭州 450052；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院燒傷整形科，河北 石家莊 053600)

骨質(zhì)疏松是以骨密度降低及其顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化為主要特征的一類型疾病。骨質(zhì)疏松的發(fā)病與年齡呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，尤其在40歲以上人群其相關(guān)性更加明顯[1-2]。目前，我國60歲及以上人口總數(shù)已達(dá)到總?cè)丝跀?shù)的13.26%[3]。對于骨質(zhì)疏松的治療現(xiàn)以使用骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑等治療為主，雖然藥物療效確切，但不良反應(yīng)也十分明顯，尋找毒副作用小的治療藥物顯得尤為重要[4]。肉蓯蓉是名貴中藥之一，又有沙漠人參的美譽(yù)。中國藥典記載，肉蓯蓉具有補(bǔ)肝腎、益精氣的功效[5]。現(xiàn)代藥理研究[6]證實(shí)：肉蓯蓉具有一定的雌激素樣作用。而雌激素是治療女性骨質(zhì)疏松的臨床常用藥物之一。國內(nèi)外暫無使用肉蓯蓉醇提物(cistanche deserticola ethanol extraction,CDE)進(jìn)行骨質(zhì)疏松治療的研究，因此本文作者旨在探討CDE對去卵巢所致的骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用及其機(jī)制，為肉蓯蓉的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、主要試劑和儀器雌性SD大鼠72只， SPF級，體質(zhì)量140～180 g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK(豫) 2005-0001。飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物房，室溫(23±2)℃，光照與黑暗時間各12 h。戊酸雌二醇，購于德國拜耳公司，使用前用生理鹽水配置成0.3 g·L-1注射液。肉蓯蓉，購于北京同仁堂，打粉過10 mm篩，加入75%乙醇溶液利用索氏提取器，回流提取4 h，共提取2次，合并2次提取液，置于負(fù)壓的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃濃縮至生藥量為1 g·mL-1。骨鈣素試劑盒(南京建成生物工程研究所)，堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒(美國R&D公司)，多聚甲醛(天津大茂化學(xué)試劑有限公司)，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。恒溫水浴槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，骨密度儀(美國HOLOGIC公司)，全自動生化儀(河北厚德漢方醫(yī)療器械公司)，常溫低速離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-rad 公司)，骨密度儀和生物力學(xué)試驗(yàn)儀(英國LLOYD公司)，游標(biāo)卡尺(廣州晨光科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組、造模和給藥72只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組，模型組，雌二醇組(0.3 mg·kg-1)，低、中和高劑量(0.5、1.0和2.0 g·kg-1)CDE組；每組12只。除對照組外，其余各組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)。3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，使用剃毛器剔除背部中下部分毛發(fā)，酒精及碘酒雙重消毒后，背部正中間開口，分別往兩邊扯動找到卵巢位置。使用手術(shù)線結(jié)扎子宮頂端后，剪除雙側(cè)卵巢，最后傷口縫合，并撒上青霉素。對照組大鼠于卵巢周圍剪去少量脂肪。手術(shù)完成后，大鼠置于暖爐旁恢復(fù)，并連續(xù)3 d肌肉注射青霉素預(yù)防感染(每天20萬單位)。手術(shù)后第5天，待動物狀態(tài)恢復(fù)正常后，開始灌胃給藥。

1.3 大鼠右側(cè)股骨密度測定給藥20周后，麻醉大鼠，腹主動脈取血完成后，分離大鼠右側(cè)股骨。鈍性分離股骨后，使用紗布擦去股骨附近肌肉及組織，采用骨密度儀對離體大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行密度分析。

1.4 大鼠左側(cè)股骨生物力學(xué)測定給藥20周后，麻醉大鼠，腹主動脈取血完成后，分離大鼠左側(cè)股骨。4℃儲存股骨，直至實(shí)驗(yàn)前24 h，室溫解凍股骨，并與實(shí)驗(yàn)前用濾紙吸干表面水分。置于生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀上測定左側(cè)股骨生物力學(xué)變化。設(shè)定參數(shù)為跨距20 mm，加速度為1 mm·min-1。實(shí)驗(yàn)完成后，使用游標(biāo)卡尺測定股骨斷面內(nèi)外徑。按文獻(xiàn)[6]中的方法，計(jì)算左側(cè)股骨最大彎曲力、最大應(yīng)變和骨剛性。

1.5 大鼠血清中ALP和骨鈣素水平測定給藥20周后，麻醉大鼠，腹部下部開口，使用草紙撥開腸及腸下黏膜，暴露腹主動脈，使用一次性采血針與配套的采血管，與腹主動脈下部Y字岔口處進(jìn)針取血，每只大鼠約取5 mL全血。室溫靜止4 h，使得血液完全凝固。3 500 r·min-1、離心10 min，取血清。按照ALP及骨鈣素ELISA試劑盒說明，測定血清中ALP和骨鈣素水平。

1.6 大鼠血清中鈣離子和磷離子水平測定按1.7中所述分離血清，取1 mL血清置于全自動生化儀中，測定血清中鈣離子和磷離子的水平。

1.7 觀察HE染色大鼠子宮組織形態(tài)表現(xiàn)給藥20周后，麻醉大鼠，腹主動脈取血完成后，分離大鼠子宮。取大鼠子宮左側(cè)靠中部的部分，4%多聚甲醛固定48 h。送檢本醫(yī)院病理科進(jìn)行石蠟切片，HE染色后觀察子宮組織形態(tài)表現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠右側(cè)股骨密度與對照組比較，模型組大鼠右側(cè)股骨密度明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，雌二醇組及低、中和高劑量CDE組大鼠右側(cè)股骨密度明顯升高(P<0.05或P<0.01)。 見表1。

2.2 各組大鼠左側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)與對照組比較， 模型組大鼠左側(cè)股骨的最大彎曲力、最大應(yīng)變及骨剛性明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，雌二醇組、中和高劑量CDE組大鼠的最大彎曲力、最大應(yīng)變及骨剛性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且中和高劑量CDE組大鼠上述指標(biāo)明顯高于低劑量CDE組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠右側(cè)股骨密度和左側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group;#P<0.05 compared with low dose of CDE group.

2.3 各組大鼠血清中ALP和骨鈣素水平與對照組比較，模型組大鼠血清ALP和骨鈣素水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，雌二醇組和中、高劑量CDE組大鼠血清ALP水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且中和高劑量CDE組大鼠血清ALP水平低于低劑量CDE組(P<0.05)。與模型組比較，雌二醇組和高劑量CDE組大鼠血清骨鈣素水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且高劑量CDE組大鼠血清骨鈣素水平明顯低于低和中劑量CDE組(P<0.05)。見表2。

2.4 各組大鼠血清中鈣離子和磷離子水平與對照組比較，模型組大鼠血清鈣離子的水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，雌二醇組及低、中和高劑量CDE組大鼠的鈣離子水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。各組大鼠血清磷離子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠血清中ALP和骨鈣素水平

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group;#P<0.05 compared with low dose of CDE group;○P<0.05 compared with middle dose of CDE group.

表3 各組大鼠血清中鈣離子和磷離子水平

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

2.5 HE染色觀察各組大鼠子宮組織形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞排列整齊，腺體上皮呈高柱狀，間質(zhì)疏松，腺腔較大。模型組大鼠子宮內(nèi)膜萎縮，腺體上皮呈低柱狀，固有層組織較致密，上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)較少。雌二醇組大鼠子宮內(nèi)膜增厚，腺體上皮呈高柱狀，上皮細(xì)胞肥大，胞漿豐富，腺體肥大。低、中和高劑量CDE組大鼠子宮內(nèi)膜上皮較模型組明顯增厚，腺體上皮呈高柱狀致密排列，間質(zhì)較為致密，且隨劑量增加，腺體數(shù)量明顯增加。見圖1(插頁三)。

3 討 論

骨質(zhì)疏松是老年常見病之一，尤以女性發(fā)病率較高，其根本原因在于女性更年期后，機(jī)體雌激素水平的降低[7-8]。隨著年齡的增加，人體各類型的激素水平產(chǎn)生波動，女性的雌激素分泌水平明顯降低，這些因素均會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。卵巢摘除手術(shù)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，模擬了這一疾病的進(jìn)程，是目前篩選骨質(zhì)疏松藥物的首選動物模型[9]。本研究在手術(shù)造模后，使用青霉素注射的方法，消除了動物感染對實(shí)驗(yàn)造成的誤差，并且明顯提高手術(shù)后動物的成活率。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松屬于“骨萎”的范圍，病因以腎虛、肝血虧虛為主。肉蓯蓉有沙漠人參的美譽(yù)，是中藥中的上品[10]，肉蓯蓉補(bǔ)腎的中醫(yī)功效與骨質(zhì)疏松“骨萎”的中醫(yī)本質(zhì)相對應(yīng)，中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨，生髓”。補(bǔ)腎不僅可以糾正免疫力低下，加強(qiáng)下丘腦垂體性腺功能，還可以改善腸道對鈣離子等關(guān)鍵離子的吸收，促進(jìn)骨吸收，加快骨形成，起到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境微量元素平衡的作用[11]。本研究采用現(xiàn)代藥理學(xué)研究的手段和方法證實(shí)了這一中醫(yī)內(nèi)涵，發(fā)現(xiàn)CDE具有提高骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、改善骨生物力學(xué)功能的作用。ALP及骨鈣素大部分由骨細(xì)胞合成，在骨的礦化過程中起到關(guān)鍵性的作用，而去卵巢大鼠由于雌激素的缺失會代償性增加ALP和骨鈣素的分泌[12-13]。臨床研究[14]表明：婦女的骨鈣素和ALP在絕經(jīng)后的一段時間內(nèi)均會保持在較高水平。血清中的多項(xiàng)指標(biāo)，現(xiàn)在均已經(jīng)作為診斷和預(yù)防措施選擇的指標(biāo)之一[15]。去卵巢大鼠模擬是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，即卵巢摘除后破骨細(xì)胞骨吸收活性明顯增強(qiáng)，伴隨成骨細(xì)胞活性代謝性上調(diào)，骨代謝速率加快，ALP作為成骨細(xì)胞分泌物，可與血液中的鈣離子相互作用共同促進(jìn)骨質(zhì)的合成[16-17]。因此血清中的ALP和鈣離子水平可以反映骨代謝的速率。本研究結(jié)果顯示：去卵巢模型大鼠血清ALP水平明顯升高，鈣離子濃度降低，而肉蓯蓉給藥組則能夠有效地逆轉(zhuǎn)這一趨勢，起到治療骨質(zhì)疏松的作用。骨骼是運(yùn)動系統(tǒng)的重要組成部分，而骨骼的質(zhì)量主要體現(xiàn)在生物力學(xué)功能上，骨質(zhì)疏松患者骨組織中鈣質(zhì)大量流失，可以導(dǎo)致包括最大彎曲力、最大應(yīng)變、骨剛性在內(nèi)的多種骨功能下降[18]。本研究結(jié)果顯示：CDE給藥后可以有效地改善去卵巢所導(dǎo)致大鼠股骨生物力學(xué)功能下降。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)了肉蓯蓉具有雌激素樣作用，這也是肉蓯蓉能夠起到治療骨質(zhì)疏松的原因之一。

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