蘇 寒，張美家，王懷杰，李 娜，霍連廣，李桂芝，戴 功，高志芹，楊曉云1,，曲梅花

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院山東省高校應(yīng)用藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；3. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；4. 濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

Exendin-4(Ex-4)是從墨西哥巨型蜥蜴的唾液中分離得到的一種氨基酸多肽，可促進(jìn)胰島素分泌[1]，改善胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。Ex-4具有穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在臨床用于治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，其治療機(jī)制仍未完全闡明[2]。IR與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，其中主要包括T2DM，如何改善IR是尋求治療T2DM及其他代謝疾病的一個(gè)重要途徑[3-4]。有研究[5]表明：IR在T2DM中更為普遍，導(dǎo)致了T2DM脂代謝的紊亂。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和載脂蛋白B100(apolipoprotein B100，apoB100)是維持肝臟脂代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。本研究通過建立HepG2細(xì)胞IR模型，研究Ex-4處理對(duì)IR細(xì)胞葡萄糖消耗、細(xì)胞內(nèi)脂肪和甘油三酯(triglyceride,TG)的影響，以及對(duì)脂代謝相關(guān)因子ACC、FAS、SREBP-1c和 apoB100等表達(dá)的影響，闡明Ex-4對(duì)肝細(xì)胞脂代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑人肝癌HepG2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清、胰酶、油紅O、蘇木素和牛胰島素(北京索萊寶科技有限公司)，Ex-4(美國(guó)MedChemExpress公司)，甘油三酯檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白定量試劑盒和Trizol(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，SYBR Green PCR(日本TOYOBO公司)，PCR 引物(上海生工生物工程有限公司)，葡萄糖檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2 HepG2細(xì)胞IR模型建立HepG2細(xì)胞按1∶3比例傳代后，用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待到細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右，將細(xì)胞分為對(duì)照組和胰島素組。待細(xì)胞培養(yǎng)12 h 后，對(duì)照組加入不含胰島素的DMEM培養(yǎng)基，將李秀麗等[7]建立模型方法進(jìn)行改進(jìn)，胰島素組分別加入含1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰島素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、36和48 h。處理后分別取出細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，應(yīng)用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)檢測(cè)上清葡萄糖濃度，計(jì)算葡萄糖消耗量(mmol·L-1)。葡萄糖消耗量最低的一組即IR最佳模型組(葡萄糖消耗量=模型初始葡萄糖濃度-建模后葡萄糖濃度)。HepG2細(xì)胞建立IR模型(HepG2-IR細(xì)胞)后，然后將細(xì)胞分為對(duì)照組(不含胰島素誘導(dǎo))、IR組(IR模型，即HepG2-IR細(xì)胞)和Ex-4組(HepG2-IR細(xì)胞中加入10 nmol·L-1Ex-4)。

1.3 油紅O染色在裝有載玻片的6孔板中建立HepG2細(xì)胞IR模型(HepG2-IR細(xì)胞)，IR模型建成后分組同上。吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油紅O工作液孵育10 min；細(xì)胞爬片破膜10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，入油紅O工作液37℃染色1～2 h。蘇木素復(fù)染1～2 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。在顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴形成情況。用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞含脂率。細(xì)胞含脂率=(實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.4 TG 水平檢測(cè)細(xì)胞分組同上。細(xì)胞長(zhǎng)滿約1×106mL-1時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化，離心留沉淀，PBS洗3次后再次離心，留沉淀； 加入少許裂解液進(jìn)行裂解，取部分上清液檢測(cè)TG水平。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中脂類代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平HepG2細(xì)胞建立IR模型后，分組同上。每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入Trizol 1 mL，利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RNA定量后進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。建立PCR反應(yīng)體系，其中ACC、FAS、SREBP-1c和apoB100及GAPDH引物序列見表1，以GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、10 min，變性95℃、10 s，退火60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為：從55℃到95℃，每隔10 s 增加0.5℃。使用LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上機(jī)擴(kuò)增，得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 IR模型建立在不同濃度胰島素作用下，HepG2細(xì)胞在24、36和48 h時(shí)葡萄糖消耗量見表2。與對(duì)照組比較，胰島素濃度為1×10-7mol·L-1作用36 h, HepG2葡萄糖消耗量最低，故本次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的胰島素濃度為1×10-7mol·L-1、作用時(shí)間36 h為最佳造模條件。

2.2 各組細(xì)胞葡萄糖消耗量HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)成IR形成后，采用GOD-POD法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖消耗量，IR組(36 h, 胰島素濃度為1×10-7mol·L-1)細(xì)胞葡萄糖消耗量[(1.656±0.133)mmol·L-1)]明顯低于對(duì)照組[(1.845±0.138)mmol·L-1)](P<0.01)，說明IR模型已建立。

與IR組比較，Ex-4組細(xì)胞的葡萄糖消耗量 [(2.190±0.080)mmol·L-1)] 明顯升高(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)及TG水平油紅O染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，IR組HepG2-IR細(xì)胞中紅色脂滴明顯增多；與IR組比較，Ex-4組細(xì)胞中紅色脂滴明顯減少(圖1，見插頁二)。與對(duì)照組(25%±6%)比較，IR組細(xì)胞含脂率(63%±12%)明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，Ex-4組細(xì)胞含脂率(34%±8%)明顯降低(P<0.05)。各組細(xì)胞中TG水平(mmol·g-1)檢測(cè)：與對(duì)照組(0.21±0.03)比較，IR組HepG2-IR細(xì)胞中TG水平(0.33±0.08)明顯升高(P<0.05)；Ex-4組HepG2-IR細(xì)胞中TG水平(0.24±0.04)明顯低于IR組(P<0.05)，接近對(duì)照組HepG2細(xì)胞中TG水平(P>0.05)，表明Ex-4通過調(diào)節(jié)TG的代謝影響細(xì)胞的脂質(zhì)代謝途徑，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚。

表2 不同濃度胰島素作用HepG2細(xì)胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

Tab.2 Glucose consumption of HepG2 cells treated with different concentrations of insulin for 24, 36 and 48 h

表2 不同濃度胰島素作用HepG2細(xì)胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

GroupGlucoseconsumption(t/h) 243648Control1．645±0．0981．845±0．1382．148±0．143Insulin(mol·L-1) 1×10-81．723±0．147?1．737±0．042?2．148±0．182 1×10-71．703±0．067?1．656±0．133?1．879±0．127 1×10-61．834±0．183?1．762±0．0532．012±0．129 1×10-52．034±0．108?1．937±0．0672．388±0．157

*P<0.05 compared with control group at same time.

2.4 各組細(xì)胞中脂類代謝相關(guān)因子mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，IR組HepG2-IR細(xì)胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，apoB100 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與IR組比較，Ex-4細(xì)胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，apoB100 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組HepG2細(xì)胞中脂類代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with IR group.

3 討 論

胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是腸道分泌的一種腸促胰島素[8]，能夠刺激胰島β細(xì)胞分化，改善細(xì)胞的胰島素敏感性，降低血糖，但其半衰期較短，作為臨床藥物常受到制約[9-11]。作為第一個(gè)臨床使用的GLP-1類似物藥物，Ex-4的特點(diǎn)是可模擬人體內(nèi)自然分泌的激素，調(diào)節(jié)血糖水平，且與GLP-1有相似的生物學(xué)作用，Ex-4具有半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，在研究中更具有優(yōu)勢(shì)[12-13]。

IR與脂代謝異常有密切關(guān)聯(lián)，所以研究脂代謝的變化是尋找改善IR的一個(gè)重要途徑。本文作者主要是通過觀察Ex-4調(diào)節(jié)脂代謝的相關(guān)因子來探討Ex-4對(duì)IR的影響。脂代謝相關(guān)因子ACC和FAS是脂肪酸合成限速酶[14]，ACC、FAS等因子表達(dá)水平明顯增加，可引起肝臟內(nèi)脂肪酸合成增加、積累，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂代謝異常，從而進(jìn)一步加重IR；FAS還在結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂蛋白代謝等方面具有重要作用，其表達(dá)水平的升高能夠明顯增加TG在體內(nèi)的沉積從而使糖尿病的脂代謝紊亂[15-16]。本研究結(jié)果顯示： IR形成后，脂肪酸合成增加，脂類物質(zhì)聚集，ACC和FAS表達(dá)水平升高。

SREBP-1c是核轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪酸的合成中發(fā)揮重要作用，SREBP-1c活性升高引起攝入游離脂肪酸增加[17]。本研究顯示：HepG2-IR細(xì)胞經(jīng)Ex-4處理后，SREBP-1c表達(dá)水平降低，提示Ex-4能夠減少游離脂肪酸的生成，改善脂肪酸合成異常的現(xiàn)象，使脂肪酸合成減少。apoB100在肝臟中合成，是低密度脂蛋白的載脂蛋白，參與低密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)[18-19]。本研究結(jié)果顯示：Ex-4處理HepG2-IR細(xì)胞后，apoB100 mRNA表達(dá)水平升高，說明Ex-4通過影響apoB100表達(dá)使其能夠加劇游離脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。

研究[20]表明：Ex-4可提高誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的葡萄糖攝取量，從而改善脂肪細(xì)胞的IR。Ex-4在抑制人或動(dòng)物體質(zhì)量增長(zhǎng)、促進(jìn)膽固醇代謝和改善胰島素敏感性方面具有重要作用，可防止高脂誘導(dǎo)的IR[21-22]。本研究結(jié)果顯示：Ex-4能夠增加 HepG2-IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量，降低TG的水平，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，Ex-4可調(diào)節(jié)脂代謝的過程，改善脂肪酸合成異常，進(jìn)而改善IR。本研究結(jié)果為Ex-4成為臨床一線抗糖尿病藥物提供了理論依據(jù)。

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