王瑋瑤，陳 玲，岳學(xué)玲，金清華

( 1. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132021)

應(yīng)激是普遍存在于生活中不可避免的事件，雖然應(yīng)激對維持機體生命活動具有重要意義，但其也可作為病因或誘因影響著多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]，因此應(yīng)激對機體損傷的作用機制和防治措施正引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。學(xué)習(xí)和記憶是非常重要的腦高級功能，決定著自我意識和對外界環(huán)境的認(rèn)知，應(yīng)激對不同年齡個體的學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生不同的影響。在穿梭箱回避實驗中，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致成年大鼠學(xué)習(xí)能力下降，而不影響幼年大鼠的學(xué)習(xí)能力[2]；在老年大鼠，慢性應(yīng)激可增加海馬內(nèi)β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的水平而導(dǎo)致認(rèn)知障礙[3]。隨著世界老齡化的發(fā)展，老年癡呆已成為一個嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題[4]，若能闡明應(yīng)激對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及其作用機制，可為改善老年人的學(xué)習(xí)記憶能力并有效防治老年性癡呆等認(rèn)知功能相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。海馬是哺乳類動物學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，研究[5-6]顯示：海馬的結(jié)構(gòu)和功能易受應(yīng)激的影響，但有關(guān)應(yīng)激對海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶功能的作用機制，尤其是涉及神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)化學(xué)機制研究較少。天冬氨酸(asparate，Asp)和谷氨酸(glutamate,Glu)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中典型的興奮性氨基酸，均作用于N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體產(chǎn)生相應(yīng)的生理功能[7]。本課題組前期研究[8-9]結(jié)果顯示：海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)區(qū)的Asp和Glu參與成年雄性大鼠的主動回避學(xué)習(xí)過程，但其在慢性應(yīng)激誘發(fā)的老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶異常中的作用目前尚未見報道。本研究應(yīng)用Morris水迷宮(morris water maze，MWM)實驗檢測慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress,CRS)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，同時采用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察大鼠海馬DG區(qū)Asp和Glu水平的變化，初步探討慢性應(yīng)激影響老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的部分神經(jīng)化學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康雄性SD大鼠16只，18個月齡，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK (吉) 2017-0003。水合氯醛(天津市大茂供應(yīng)站)，OPA(ophthaldialdehyde，美國Sigma公司)，氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、Asp和Glu(日本NACALAI株式會社)，異氟烷(魯南貝特制藥有限公司)，ELISA 試劑盒(美國CUSABIO公司)。8R-6型腦立體定位儀(日本成茂公司)，HTEC-300型生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng)、ESP-64型微量灌注泵和EFC-82型自動樣本收集器(日本EICOM公司)，MWM實驗系統(tǒng)(中國上海吉量科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組及處理SD大鼠隨機分為對照組和CRS組，每組8只。CRS組大鼠接受CRS，具體方法如下：將清醒大鼠單獨置于長18～20 cm(可調(diào)節(jié))、寬約7 cm、兩端各有一個通氣孔(直徑1 cm)的透明束縛器內(nèi)給予束縛刺激(只允許大鼠輕微活動)，束縛期間大鼠禁食禁水；大鼠在每天的同一時間接受2 h的束縛刺激1次，連續(xù)30 d。對照組大鼠不進行處理。

1.3 微量透析探針的插入最后1次束縛刺激結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg·kg-1)麻醉后固定在腦立體定位儀上。碘伏消毒，剪開頭皮及腦膜，暴露前后囟，參照Paxinos和Watson圖譜，將探針外套管(外徑0.9 mm)固定在一側(cè)海馬高于DG區(qū)1.5 mm 的部位(坐標(biāo)為：前囟后3.4 mm,旁開 1.6 mm,深3.0 mm)，用牙科水泥固定于顱骨上。大鼠單獨飼養(yǎng)并恢復(fù)3 d后，在清醒狀態(tài)下經(jīng)外套管向海馬DG區(qū)插入自制的微量透析探針，并用蠟固定于外套管上。微量透析探針超出外套管1.5 mm，尖端為乙酸纖維素半透膜(外徑0.2 mm)，濾過相對分子質(zhì)量小于50 000的物質(zhì)。

1.4 MWM實驗大鼠海馬DG區(qū)插入微量透析探針后，適應(yīng)MWM系統(tǒng)2 min，第2天開始為期5 d的MWM檢測[10]，檢測方法及觀察指標(biāo)如下：MWM定位航行實驗時，記錄大鼠自入水到找到站臺后四肢爬上站臺所需的時間(即逃避潛伏期)，若大鼠在120 s內(nèi)找到站臺，記錄所需的時間作為逃避潛伏期，若大鼠在120 s內(nèi)未找到站臺，則將其引至站臺并停留15 s，潛伏期記為120 s，大鼠每天訓(xùn)練1次，連續(xù)訓(xùn)練4 d；MWM檢測第5天，撤去水池中的圓形平臺進行空間探索實驗，記錄120 s內(nèi)大鼠在每個象限游泳的時間百分比。

1.5 大鼠海馬 DG區(qū)興奮性氨基酸水平的測定[9]MWM實驗開始前和每天訓(xùn)練結(jié)束后，將微量透析探針與微量灌注泵連接，用Ringer’s液(147 mmol·L-1NaCl，4 mmol·L-1KCl，2.3 mmol·L-1CaCl2,pH 6.5)以1.5 μL·min-1速度進行灌流，利用自動樣本收集器收集大鼠海馬DG區(qū)微量透析樣本10 min。取12 μL的透析樣本與3 μL的4 mmol·L-1OPA溶液混合，常溫下反應(yīng)2.5 min后抽取10 μL的反應(yīng)液注入到生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng)中，經(jīng)高效液相色譜分離柱和電化學(xué)檢測器測定各個樣本中興奮性氨基酸(Asp和Glu)的濃度。

1.6 血清應(yīng)激激素水平測定及組織學(xué)鑒定實驗結(jié)束后，用異氟烷將大鼠麻醉，取心臟血，室溫下3 000 r·min-1速度離心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存。采用ELISA 法檢測大鼠血清中皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)和腎上腺素(epinephrine，EPI)水平，以確定CRS組大鼠的應(yīng)激水平。將大鼠斷頭取腦，用10%甲醛溶液固定腦組織3 d后進行冰凍切片，中性紅染色，鑒定微量透析探針到達部位，數(shù)據(jù)統(tǒng)計只采用探針進到海馬 DG區(qū)者的數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力2組大鼠在4 d 的MWM定位航行訓(xùn)練過程中，逃避潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逐漸減少，與對照組比較，CRS組大鼠第2～4天的逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，提示CRS降低老年大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。第5天MWM檢測，撤去隱藏站臺進行空間探索實驗，2組大鼠在目標(biāo)象限(第三象限)游泳的時間百分比均明顯長于其他象限(P<0.05)，CRS組大鼠在目標(biāo)象限游泳的時間百分比明顯少于對照組(P<0.05)，提示CRS可降低老年大鼠的空間記憶能力。見表1和2。

表1 MWM實驗中2組大鼠的逃避潛伏期

Tab.1 Escape latencies of rats in MWM test in two groups

表1 MWM實驗中2組大鼠的逃避潛伏期

GroupEscapelatency(t/d) 1234Control79．53±9．1745．17±11．93△34．09±6．18△22．22±4．01△CRS94．09±16．2072．05±12．56?63．01±5．83?△37．88±6．73?△

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 1 d.

表2 MWM實驗中2組大鼠在各象限游泳的時間百分比

*P<0.05 compared with control group ;△P<0.05 compared with 25% chance level in each quadrant.

2.2 各組大鼠海馬DG區(qū)Asp和Glu水平大鼠海馬DG區(qū)的Asp和Glu水平以MWM訓(xùn)練前水平為100%計算出每天訓(xùn)練后的變化百分比來表示。與訓(xùn)練前比較，對照組大鼠訓(xùn)練第1天的海馬DG區(qū)Asp水平明顯增加(P<0.05)；而CRS組大鼠海馬DG區(qū)Asp水平在訓(xùn)練第3天明顯降低(P<0.05)，訓(xùn)練第3天時2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與訓(xùn)練前比較，對照組(訓(xùn)練第2和3天)和CRS組(訓(xùn)練第2和4天)大鼠海馬DG區(qū)Glu水平均明顯增加(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組大鼠海馬DG區(qū)Asp和Glu水平

Tab.3 Levels of Asp and Glu in hippocampal DG of rats in two groups

表3 2組大鼠海馬DG區(qū)Asp和Glu水平

GroupAsp(t/d)012345Control 100111．79±2．92△125．09±22．39141．56±24．08102．01±19．31110．23±35．39CRS 100122．85±36．6190．32±14．3272．92±13．14?△94．99±34．7786．71±19．90GroupGlu(t/d)012345Control 100185．59±53．50245．19±58．01△343．61±110．94△349．50±163．12322．61±143．22CRS 100138．96±25．64295．40±64．01△219．23±79．14273．42±62．13△161．64±61．09

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 0 d.

2.3 各組大鼠血清中應(yīng)激激素水平的變化采用ELISA 法測定大鼠血清中CORT與EPI的水平，以評價CRS是否引起應(yīng)激反應(yīng)。CRS組大鼠血清中的CORT和EPI水平較對照組明顯升高(P<0.05)，提示CRS組大鼠處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。見表4。

表4 2組大鼠血清中CORT和EPI水平

*P<0.05 compared with control group.

3 討 論

目前世界的人口老齡化程度不斷加劇，導(dǎo)致老年癡呆逐年增加，并已成為醫(yī)學(xué)和社會問題的焦點，而老年癡呆性認(rèn)知障礙的初始表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退[4]。眾所周知，海馬是哺乳類動物學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。文獻[11]報道：在老化大鼠出現(xiàn)海馬內(nèi)Aβ沉積、神經(jīng)元變性及突觸可塑性異常等,表明海馬結(jié)構(gòu)和功能的異常參與老年性學(xué)習(xí)記憶能力減退。應(yīng)激是日常生活中普遍存在的現(xiàn)象，可以影響人類和動物的各種生理功能，包括學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能[12]。海馬是腦內(nèi)對應(yīng)激及相關(guān)激素最為敏感的部位之一，研究[5-6]表明：應(yīng)激可誘發(fā)海馬神經(jīng)元形態(tài)異常、神經(jīng)發(fā)生減少以及海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶能力的改變等。文獻[3,5,13]報道：慢性應(yīng)激可損傷老齡大鼠的海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶功能及其相關(guān)突觸可塑性，但對此作用的神經(jīng)化學(xué)機制目前尚不完全清楚。先前的研究[8-9]表明：海馬DG區(qū)的Asp和Glu參與成年雄性大鼠的主動回避學(xué)習(xí)過程，其中Asp可能與急性應(yīng)激降低成年大鼠空間學(xué)習(xí)能力有關(guān)[14]，但其在慢性應(yīng)激誘發(fā)的老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶異常中的作用目前尚未見報道。本研究對18月齡的老齡大鼠給予30 d的CRS，觀察其對空間學(xué)習(xí)記憶及海馬DG區(qū)Asp和Glu水平的影響。應(yīng)激的經(jīng)典內(nèi)分泌系統(tǒng)有交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸系統(tǒng)，前者激活后會導(dǎo)致EPI的釋放，而后者激活則導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素(嚙齒類動物為CORT)的分泌。在本研究中，CRS組大鼠血清中CORT和EPI水平均明顯高于對照組，提示給予CRS使大鼠處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。本實驗結(jié)果還顯示：與對照組比較，MWM實驗檢測中CRS組大鼠的逃避潛伏期明顯延長而在目標(biāo)象限的時間明顯減少，提示CRS可明顯降低老齡大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

哺乳類動物海馬的主要亞區(qū)有CA1、CA3和DG區(qū)，其中DG區(qū)作為新信息進入海馬的傳入點在空間信息的處理和編碼中起至關(guān)重要的作用。突觸效應(yīng)長時程增強(long-term potentiation,LTP)是突觸可塑性的典型表現(xiàn)，也是海馬依賴性學(xué)習(xí)功能的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)。目前研究[15]認(rèn)為：海馬DG區(qū)的LTP是NMDA受體依賴性的，即突觸后膜的NMDA受體大量激活，引起突觸后膜內(nèi)Ca2+濃度明顯增加，觸發(fā)與Ca2+相關(guān)的一系列生理生化反應(yīng)，最終誘發(fā)LTP。Asp 和Glu是公認(rèn)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在海馬神經(jīng)元共同分布于相同的神經(jīng)末梢與突觸囊泡中，均以Ca2+依賴性方式釋放，前者選擇性地作用于NMDA受體，而后者作用于包括NMDA受體在內(nèi)的所有谷氨酸能受體上[16,7]。本課題組前期的實驗結(jié)果[8-9]顯示：大鼠海馬DG區(qū)的Asp和Glu水平隨著條件反射的建立逐漸升高且隨條件反射的消退逐漸回降，此變化與學(xué)習(xí)依賴性LTP變化基本對應(yīng)。上述研究提示：大鼠海馬DG區(qū)的Asp和Glu可能通過NMDA受體參與海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶功能中。本實驗結(jié)果顯示：對照組大鼠海馬DG區(qū)Asp和Glu水平在空間學(xué)習(xí)過程中有增加趨勢，表明其可能參與老齡大鼠的空間認(rèn)知過程。如前所述，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致海馬的結(jié)構(gòu)和功能的變化[3,5,13,17]，而且慢性應(yīng)激還影響海馬DG區(qū)LTP的產(chǎn)生[18]。本實驗結(jié)果顯示：CRS組大鼠海馬DG區(qū)的Glu水平變化和對照組相似，在空間學(xué)習(xí)過程中有所增加(在訓(xùn)練第2和4天與訓(xùn)練前比較)，但2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與之相比，CRS組大鼠DG區(qū)Asp水平在空間學(xué)習(xí)過程中不僅沒有增加反而有所下降(在訓(xùn)練第3天與訓(xùn)練前比較)，2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(訓(xùn)練第3天)。本研究結(jié)果提示：CRS降低老年大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力與海馬DG區(qū)Asp水平降低有關(guān)，但其具體的下游機制尚有待進一步研究。

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