潘慧欣，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是存在于骨髓中的一種非造血功能的干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新能力、多向誘導(dǎo)分化能力，兼具多器官歸巢能力及免疫原性低的優(yōu)勢，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為種子細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景，有望為臨床上難以治愈的骨科疾病提供新的治療策略。近年來，隨著對BMSCs研究的深入，其在慢性骨科疾病治療中的前景越發(fā)突顯出來。以往研究中多采用一些化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞因子，對BMSCs誘導(dǎo)分化，但由于價格昂貴和安全性問題而無法廣泛應(yīng)用于臨床實踐中。研究者把目光瞄準(zhǔn)傳統(tǒng)中藥，選擇具有滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血等功效的中藥及其有效成分作為誘導(dǎo)劑，嘗試?yán)弥兴帉MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化并取得了良好的效果，筆者就中藥誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化和成骨分化兩個方面進(jìn)行綜述，以期為骨科疾病的防治研究提供參考。

1 中藥誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化

1.1 中藥復(fù)方誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化 中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的特點(diǎn)給中藥復(fù)方的藥理研究增加了難度，血清藥理學(xué)的提出為中藥復(fù)方的研究提供了新的思路。中藥復(fù)方應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的研究，涉及軟骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)分析及信號通路的機(jī)制研究，主要涉及兩個方面。

1.1.1 中藥復(fù)方直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中的研究 透骨消痛方（劑量200 μg/mL）在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）協(xié)同條件下可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs成軟骨分化，其作用機(jī)制與活化Indian hedgehog（IHH）信號通路有關(guān)[1]。

1.1.2 中藥復(fù)方制備成含藥血清應(yīng)用于BMSCs成軟骨分化的研究 研究發(fā)現(xiàn)右歸飲含藥血清促進(jìn)大鼠BMSCs成軟骨分化的機(jī)制與抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路的4個關(guān)鍵基因MAPK13，MAPK14，腫瘤壞死受體相關(guān)因子6（TRAF-6）和MAP3K7中的某個或全部基因的表達(dá)，上調(diào)miR-24-3p的表達(dá)，阻斷p38 MAPK信號通路的部分通路有關(guān)[2]；透骨消痛顆粒含藥血清可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs成軟骨分化，且效果強(qiáng)于軟骨誘導(dǎo)劑[3]；此外，龜鹿二仙湯含藥血清也可誘導(dǎo)兔BMSCs成軟骨分化[4]。

1.2 中藥提取物誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化 中藥提取物在質(zhì)量控制方面較中藥復(fù)方更有優(yōu)勢。其應(yīng)用于BMSCs成軟骨分化的研究主要是關(guān)于軟骨功能表達(dá)及參與的信號通路的機(jī)制研究。主要分兩方面。

1.2.1 中藥提取物制備成含藥血清應(yīng)用于BMSCs成軟骨分化的研究 牛膝提取物含藥血清可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 SOX9，蛋白聚糖（Aggrecan），Ⅱ型膠原（collagenⅡ）mRNA和蛋白表達(dá)，證明其可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的兔BMSCs成軟骨分化[5]；5%雪蓮花醇提取物可上調(diào)collagenⅡ和Aggrecan mRNA表達(dá)，對大鼠BMSCs成軟骨分化有促進(jìn)作用[6]。

1.2.2 中藥提取物直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中的研究 應(yīng)用骨碎補(bǔ)提取液、熟地黃提取液分別對體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs進(jìn)行成軟骨分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)提取液可促進(jìn)collagenⅡ表達(dá)，而熟地黃提取液則不能[7]；中華眼鏡蛇毒液中提取出來的神經(jīng)生長因子對體內(nèi)軟骨損傷修復(fù)和體外培養(yǎng)的兔BMSCs成軟骨分化均有促進(jìn)作用，其促進(jìn)BMSCs成軟骨分化機(jī)制與酪氨酸激酶A（TrkA）激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）和 MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路有密切的關(guān)系[8]。

1.3 中藥單體誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化 中藥單體較單味中藥或中藥復(fù)方成分單一，純度更高，更利于進(jìn)行精準(zhǔn)的分子機(jī)制研究。應(yīng)用于BMSCs成軟骨分化的中藥單體，涉及軟骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的研究及軟骨功能相關(guān)基因表達(dá)的研究，少有關(guān)于信號通路的機(jī)制研究。主要為中藥單體直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系的體外研究，按其化學(xué)成分綜述如下。

黃酮類化合物：低濃度柚皮苷與經(jīng)典誘導(dǎo)液聯(lián)合應(yīng)用于體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs成軟骨分化，可明顯增加糖胺聚糖（GAG）的分泌量，而柚皮苷單獨(dú)使用時并不能促進(jìn)BMSCs成軟骨分化，說明柚皮苷對經(jīng)典誘導(dǎo)劑促進(jìn)大鼠BMSCs成軟骨分化具有協(xié)同作用[9]；淫羊藿苷可顯著上調(diào)collagenⅡ、Aggrecan的表達(dá)，證實淫羊藿苷可促進(jìn)大鼠BMSCs成軟骨分化[10]，且淫羊藿苷的誘導(dǎo)效果比單純軟骨誘導(dǎo)劑更好，不會使BMSCs在軟骨分化過程中肥大化[11]；淫羊藿素能促進(jìn)生長分化因子-5（GDF-5）誘導(dǎo)大鼠BMSCs成軟骨分化，其作用機(jī)制可能與Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)[12]。萜類及多酚類化合物，考察白術(shù)的活性成分三環(huán)倍半萜和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）與茶黃素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人BMSCs成軟骨分化作用，都應(yīng)用到了甲苯胺藍(lán)染色法、collagenⅡ免疫組化染色法，結(jié)果均呈陽性，證明二者皆有促進(jìn)BMSCs成軟骨分化的作用[13-14]。多肽類化合物，鹿茸多肽可提高GAG含量、上調(diào)collagenⅡ的mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)體外培養(yǎng)的兔BMSCs成軟骨分化[15]。

2 中藥誘導(dǎo)BMSCs成骨分化

2.1 中藥復(fù)方誘導(dǎo)BMSCs成骨分化 應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的中藥復(fù)方，涉及成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的研究、成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)和相關(guān)信號通路的機(jī)制研究。主要分為以下兩個方面。

2.1.1 中藥復(fù)方直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中的研究 梁祖建等研究補(bǔ)腎調(diào)肝方水提液（劑量1mg/mL）對體外培養(yǎng)的大鼠衰老BMSCs成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)其可使礦化鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，提示補(bǔ)腎調(diào)肝方可促進(jìn)衰老BMSCs成骨分化[16]。中藥生肌液也可促進(jìn)體外培養(yǎng)的兔BMSCs成骨分化，且1：20生肌液組誘導(dǎo)效果最佳[17]。

2.1.2 中藥復(fù)方制備成含藥血清應(yīng)用于BMSCs成骨分化的研究 補(bǔ)腎填精方（又稱骨康方）可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠及小鼠BMSCs成骨分化，其促進(jìn)BMSCs成骨分化的機(jī)制與多條信號通路有關(guān)，可使成骨標(biāo)記物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）及p38、激活轉(zhuǎn)錄因子（ATF-2）蛋白及基因表達(dá)上調(diào)，提示其作用機(jī)制與激活p38信號通路有關(guān)[18]，可顯著上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路主要蛋白β-連環(huán)蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5、T細(xì)胞因子的表達(dá)，提示其作用機(jī)制與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)[19]；研究發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清可促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化[20]，可使成骨相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而基因甲基化率下調(diào)，提示其作用機(jī)制與去甲基化的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制相關(guān)[21]；青娥方含藥血清可提高ALP活性、上調(diào)TGF-β1 mRNA表達(dá)，促進(jìn)分離自絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的小鼠BMSCs成骨分化[22]。

2.2 中藥提取物誘導(dǎo)BMSCs成骨分化 應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的中藥提取物，多為植物藥提取物，具體分述如下。

巴戟天多糖可促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化，其作用機(jī)制可能與激活p38 MAPK信號通路有關(guān)[23]；牛膝提取物可通過核因子κB受體活化因子/核因子κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素（RANKL/RANK/OPG）信號通路的調(diào)節(jié)預(yù)防激素引起的激素性股骨頭壞死，減輕激素誘導(dǎo)的骨退化，側(cè)面說明牛膝提取物可促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化[24]。升麻提取物也可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs成骨分化，其機(jī)制與雌激素受體/一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷（ER/NO/cGMP）信號通路有關(guān)[25]。杜仲醇提取物可促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化，其作用機(jī)制主要與響應(yīng)Wnt信號通路中的跨膜受體卷曲蛋白2（Fzd2）和Fzd3受體分子有關(guān)[26]。

2.3 中藥單體誘導(dǎo)BMSCs成骨分化 應(yīng)用于BMSCs成骨分化的中藥單體，涉及成骨相關(guān)基因、蛋白表達(dá)及信號通路的機(jī)制研究。主要為中藥單體直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系的體外研究，按中藥單體的化學(xué)成分綜述如下。

多糖類成分：黃精多糖可提高堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原氨基端肽（PINP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）、骨涎蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠BMSCs成骨分化[27]。醌類化合物：大黃素不僅可促進(jìn)去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，同時還能抑制其向成脂分化[28]。苯丙素類化合物：異補(bǔ)骨脂素可提高堿性成纖維細(xì)胞因子，胰島素樣生長因子-1，Osterix和RUNX2的mRNA表達(dá)來促進(jìn)BMSCs成骨分化[29]。黃酮類化合物：包括金雀異黃酮、淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷、淫羊藿次苷和槲皮素。金雀異黃酮促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化的機(jī)制可能與激活p38 MAPK信號通路有關(guān)[30]。淫羊藿總黃酮含藥血清可促進(jìn)人及大鼠BMSCs成骨分化，其作用機(jī)制與BMP和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)[31]；淫羊藿苷可促進(jìn)大鼠、山羊及人BMSCs成骨分化，且作用機(jī)制與BMP-2，OCN，Osterix和RUNX2mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)[32-33]；淫羊藿苷成骨能力，與淫羊藿次苷Ⅱ比較，淫羊藿次苷Ⅱ誘導(dǎo)效果更佳，其促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化的機(jī)制與激活雌激素信號通路有關(guān)[34]；槲皮素促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化的作用機(jī)制與激活ERK1/2和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路或ERK和p38信號通路有關(guān)[35-36]。多酚類化合物：白藜蘆醇可通過抑制NF-κB信號通路來保護(hù)由TNF-α引起的小鼠BMSCs成骨分化抑制[37]。

3 問題與展望

目前，中藥誘導(dǎo)BMSCs成軟骨及成骨分化的研究已取得了相當(dāng)多的成果，但仍存在一些亟待解決的問題。首先，除中藥單體外，復(fù)方中藥及中藥提取物成分復(fù)雜，需進(jìn)一步確定具誘導(dǎo)分化作用的有效成分，含藥血清成分也很復(fù)雜，且目前缺乏制備含藥血清的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)量控制體系。其次，目前將中藥復(fù)方直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系用于誘導(dǎo)BMSCs成軟骨及成骨分化的體外研究較少，缺少文獻(xiàn)支持，導(dǎo)致一些研究的給藥劑量可能過大[1，16]。在實際臨床應(yīng)用中，受藥物本身生物利用度及首過效應(yīng)影響，通過口服方式在體內(nèi)的血藥濃度無法達(dá)到體外研究選擇的劑量，對骨科疾病的防治沒有實際意義。另外，中藥誘導(dǎo)BMSCs成軟骨及成骨分化機(jī)制復(fù)雜，目前對于發(fā)揮作用的相關(guān)信號通路分子機(jī)制研究較少。未來研究應(yīng)更多地結(jié)合藥代動力學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等現(xiàn)代研究手段，深入探明中藥誘導(dǎo)BMSCs成軟骨及成骨分化過程中發(fā)揮作用的有效成分以及機(jī)制通路和作用靶點(diǎn)，為中藥應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs分化治療骨科疾病提供更可靠的依據(jù)。