宋德平

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

1　病毒性腹瀉的病原學(xué)和流行病學(xué)

1.1 病原

豬腹瀉一直是困擾我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病。2010年底，大規(guī)模、嚴(yán)重豬腹瀉在我國南方地區(qū)各養(yǎng)殖場暴發(fā)，此次大規(guī)模的豬腹瀉主要表現(xiàn)為哺乳仔豬，特別是1周齡內(nèi)仔豬的水樣腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，發(fā)病率和死亡率可達(dá)80%～100%，后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、公豬及育肥豬等主要表現(xiàn)為一過性水樣腹瀉。隨后，該病迅速擴(kuò)散至國內(nèi)各養(yǎng)豬省份。2013年4月，該病首次在北美大陸暴發(fā)，并造成了超過800萬頭仔豬的死亡和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病在北美洲、亞洲及歐洲等地區(qū)的主要養(yǎng)豬國家均有報道。腹瀉是一種癥狀或癥候群，而不是一種單一的疾病。造成腹瀉的原因非常復(fù)雜，包括傳染性和非傳染性因素。傳染性因素包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，非傳染性因素則包括飼料營養(yǎng)、斷奶應(yīng)激、寒冷、潮濕等衛(wèi)生條件。病毒和細(xì)菌是引起腹瀉的常見原因，其中又以病毒性腹瀉造成的危害相對更普遍、更嚴(yán)重。研究表明，2010年以來的這一波腹瀉為病毒性病原導(dǎo)致的，以豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）感染為主，超過60%的腹瀉樣品中可檢出PEDV；傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastraenteritis virus， TGEV）和輪狀病毒（porcine rotavirus， PoRV）等腹瀉相關(guān)病毒也單獨(dú)或多重混合感染而存在于腹瀉豬群中，但兩者的檢出率相對較低，分別在0%～32%和0%～25%之間。此外，一種新的與腹瀉相關(guān)的病毒——豬δ冠狀病毒（porcine deltacoronavirus， PDCoV）從中國大陸多個省份腹瀉豬群中被檢出，檢出率在6.51%～31%，是檢出率僅次于PEDV的腹瀉病原。

1.2 流行特點(diǎn)

由于流行病原譜從原來的PEDV、TGEV和輪狀病毒為主要病原轉(zhuǎn)變?yōu)橛蒔EDV和PDCoV為主要病原，導(dǎo)致此次腹瀉流行情況與以往的流行病學(xué)和傳統(tǒng)認(rèn)識存在較大差異。針對PEDV的研究也表明，當(dāng)前流行毒株的遺傳和抗原性等均發(fā)生了變異。進(jìn)化樹分析表明，當(dāng)前主要流行PEDV毒株與主要疫苗毒株CV777處于不同的進(jìn)化分支。2010年后鑒定的PEDV中國毒株的S基因表現(xiàn)出了新的變異特征，與CV777毒株S基因核苷酸的同源性僅為89%～92%；而與2013年以來鑒定的美國PEDV毒株S基因氨基酸的同源性為93%～99%。進(jìn)化樹分析顯示，2010年后的毒株與之前的毒株全基因組及S基因（蛋白）出現(xiàn)明顯的分支。主要突變存在于S1基因區(qū)域及抗原位點(diǎn)COE（CO-26K equivalent）中的中和表位區(qū)域。CV777強(qiáng)毒株在S蛋白549及594位點(diǎn)其氨基酸為蘇氨酸和甘氨酸，而2010年后毒株在這兩個位點(diǎn)上的氨基酸均為絲氨酸，2002～2009年毒株在549位點(diǎn)為精氨酸或絲氨酸，594位點(diǎn)為絲氨酸。研究人員還發(fā)現(xiàn)了S基因大量缺失的毒株，在2008年從韓國豬群中發(fā)現(xiàn)了一株缺失了204個氨基酸（aa713-aa916）的臨床毒株，還有學(xué)者在2013年美國暴發(fā)腹瀉的豬群中檢測到了一株在S1基因缺失了197個氨基酸的臨床毒株。這些基因組中的變異及缺失也許是導(dǎo)致當(dāng)前流行毒株的致病性與2010年前毒株不同的原因，也可能是造成當(dāng)前CV777毒株的疫苗免疫后不能有效地保護(hù)豬群而導(dǎo)致PED暴發(fā)的重要原因。

新現(xiàn)的PDCoV屬于冠狀病毒科中一個新的屬——丁型冠狀病毒屬（genus deltacoronavirus），是唯一一種感染非禽類的丁型冠狀病毒。該病毒最早是香港學(xué)者從豬糞便拭子樣品中檢測到。2014年美國學(xué)者從暴發(fā)腹瀉的豬群樣品中檢出并成功分離，新生豬和新生商品仔豬攻毒試驗均表明該病毒可以導(dǎo)致新生仔豬PED、TGE樣腹瀉。臨床調(diào)查結(jié)果也證實了PDCoV可引起各階段豬只腹瀉，但主要以新生哺乳仔豬腹瀉為主；該病毒可單獨(dú)或與PEDV混合感染而存在。

1.3 傳染流行特點(diǎn)

豬病毒性腹瀉是獨(dú)立的豬急性接觸性腸道傳染病，發(fā)病豬和帶毒豬是主要的傳染源，感染后的康復(fù)豬也可作為中間傳播宿主進(jìn)行病毒傳播；同時，被病毒污染的周圍環(huán)境，如運(yùn)輸車輛、飼料、飲水、飼養(yǎng)員的衣服和鞋、用具等都可散播傳染。腹瀉病毒主要經(jīng)消化道傳播，糞——口傳播是主要的傳播途徑，但有人報道還可以通過乳汁、呼吸道等途徑傳播。研究表明，腹瀉或帶毒母豬在產(chǎn)后可通過糞便排毒，且排毒周期較長，可長達(dá)1個月。

目前，我國各年齡階段的豬只都能感染發(fā)病，其中哺乳仔豬、保育豬和育肥豬是易感染豬群。新生哺乳仔豬與哺乳母豬在同一個環(huán)境下生活，非常容易接觸到病毒，且仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，無主動免疫保護(hù)，如果母乳中無足夠的保護(hù)性抗體或仔豬無法吸吮到母乳則非常容易發(fā)病。在臨床上，較容易觀察到新生仔豬，特別是1周齡內(nèi)仔豬發(fā)病率和死亡率非常高；隨著仔豬日齡增加，其抵抗力也增強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢。另外，有報道顯示感染了其他病原，如豬圓環(huán)病毒2型、豬藍(lán)耳病病毒等會加重感染PEDV后的癥狀和病變。

2　腹瀉疫苗及免疫機(jī)理

截止2018年1月，國內(nèi)共有22家企業(yè)獲得了29個腹瀉疫苗批準(zhǔn)文號。其中有流行性腹瀉、傳染性胃腸炎病毒二聯(lián)滅活疫苗，豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎病毒二聯(lián)弱毒苗，豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒三聯(lián)滅活苗及豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒三聯(lián)弱毒苗。

2.1 滅活疫苗

早期國內(nèi)的滅活苗生產(chǎn)采用給仔豬口服強(qiáng)毒，待仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉時剖殺取腸內(nèi)容物和黏膜，加入甲醛滅活后用氫氧化鋁佐劑制備成乳劑。自1988年通過添加胰酶的方法在Vero細(xì)胞上成功分離出PEDV后，多種二聯(lián)及三聯(lián)疫苗研制成功并上市。以低代次PEDV CV777與TGEV華毒株制備的TGE-PED二聯(lián)滅活苗和PED-TGERoV三聯(lián)滅活苗使用的時間長，推廣面積大。最近兩年有基于中國PEDV新毒株ZJ08株以及2010年后變異毒株AJ1102株研制的PED-TGE二聯(lián)滅活苗上市和使用。至此，在生產(chǎn)實踐中有基于CV777毒株和新毒株（ZJ08和AJ1102）PEDV疫苗的選擇，且新毒株疫苗的使用比例呈現(xiàn)增加的趨勢。

滅活苗以其安全性高、易于運(yùn)輸和保存的特點(diǎn)，在動物疫病防控方面發(fā)揮了非常重要的作用。后海穴或頸部肌肉注射是滅活苗的免疫途徑，機(jī)體血液中產(chǎn)生的中和抗體類型主要為IgG，可保護(hù)病毒的全身感染。仔豬出生后通過吸吮母乳獲得免疫抗體，主要為IgG，也有少量的IgA。抗體通過腸上皮進(jìn)入血液循環(huán)，從而被動獲得抵抗全身感染（非腸內(nèi)感染）的免疫力。此外，滅活苗的單次免疫劑量大，通常每次需注射107.0TCID50/mL，且需要免疫2次及以上才能刺激產(chǎn)生較高水平的中和抗體。但隨著PEDV在體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，抗原含量的瓶頸得到了解決。目前，市售活苗中的抗原含量達(dá)到了107.0TCID50/mL，最近上市的AJ1102株抗原含量更是高達(dá)107.5TCID50/mL。

2.2 弱毒疫苗

當(dāng)前已有9家企業(yè)生產(chǎn)的3種PED商品化弱毒疫苗，分別為：TGEPED-RoV（弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株）三聯(lián)弱毒苗，TGE-PED（弱毒W(wǎng)H-1株+弱毒AJ1102株）二聯(lián)弱毒疫苗和TGE-PED（HB08株+ZJ08株）二聯(lián)弱毒疫苗。

PEDV、TGEV和RoV都是經(jīng)消化道感染，具有非常明顯的腸組織嗜性。對腸絨毛上皮細(xì)胞的侵染，引起腸絨毛上皮細(xì)胞的萎縮脫落，從而造成感染豬只的消化功能紊亂、酸中毒和脫水。因此，在腸腔內(nèi)阻斷腹瀉病毒感染是最直接和有效的方法。在防疫中起主要作用的抗體是循環(huán)抗體（IgG）和分泌型黏膜抗體（sIgA）。IgG的主要作用是用來抵御全身感染，而sIgA主要用來抵御黏膜感染。IgG的分子量較大，不容易穿過腸壁進(jìn)入腸腔，它們對胃酸和消化酶的抵抗力較差。sIgA也叫分泌抗體，分子量較小，它們在黏膜免疫中起主要作用，可以抵御胃酸和消化酶的消化，并且與腸黏膜有親和作用，所以IgA在腸道中起重要的作用。研究表明，母源sIgA的水平與仔豬對PEDV感染抵抗力有關(guān)，而血液中的中和抗體與其對新生仔豬的保護(hù)作用沒有相關(guān)性。因此，對于養(yǎng)殖場如何防控PEDV感染，除嚴(yán)格的生物安全外，首先要刺激動物機(jī)體產(chǎn)生特異性的高效價的sIgA抗體，是疫苗免疫的關(guān)鍵。

2.3 基因工程疫苗

新型疫苗的種類很多，包括重組活載體疫苗、核酸疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、亞單位疫苗等。目前已知制備的核酸疫苗僅在小鼠體內(nèi)證明可產(chǎn)生抗體或誘導(dǎo)體液免疫。有報道將PEDV S1基因構(gòu)建的重組腺病毒能穩(wěn)定地表達(dá)PEDV S1蛋白，為PEDV口服疫苗的研究提供了新的思路。人們還采用哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)系統(tǒng)研制了針對腹瀉病毒的亞單位疫苗，但在臨床使用上需要非常大的劑量才能達(dá)到有效的保護(hù)。目前基因工程疫苗少有商品化的，大多處于研發(fā)或試驗階段?；蚬こ桃呙缇哂兄苽浜唵?、免疫效果強(qiáng)、免疫應(yīng)答持久等優(yōu)點(diǎn)，但是同時存在潛在的一些危險，如發(fā)生自身免疫或者免疫耐受等，植物疫苗表達(dá)的蛋白是否會被動物胃腸道所消化吸收或者失活的問題。

3　腹瀉的臨床防控效果

3.1 不同疫苗類型的防控效果

當(dāng)前病毒性腹瀉主要引起10日齡以內(nèi)仔豬的嚴(yán)重發(fā)病和死亡，因此，如何給仔豬提供有效保護(hù)是疫苗研發(fā)的關(guān)鍵所在。由于主要病原為PEDV和PDCoV，目前還沒有PDCoV的疫苗上市，因此，做好PEDV的免疫保護(hù)是對當(dāng)前腹瀉防控的關(guān)鍵。盡管疫苗的使用普及率很高，但以PEDV為主要病原引起的腹瀉疫情依然持續(xù)存在。目前，絕大部分臨床流行毒株均為變異株P(guān)EDV，其與疫苗株在S基因上的差異可能是導(dǎo)致基于CV777疫苗株免疫效果不好的原因。因此，創(chuàng)制PEDV流行株的疫苗對于豬流行性腹瀉的防控是勢在必行的，當(dāng)前基于流行毒株AJ1102制備的疫苗在臨床的防控效果值得關(guān)注。

滅活苗與弱毒苗的特點(diǎn)使得兩種苗的保護(hù)效果存在較大差異。使用滅活苗免疫母豬在血清和初乳中主要是IgG抗體，且乳汁中IgG濃度隨著哺乳日齡迅速下降，對仔豬的保護(hù)有限。IgG的主要作用是用來抵御全身感染，而IgA可抵御消化道感染。接種弱毒苗后病毒可在體內(nèi)細(xì)胞上增殖，刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG和IgA，從而全面保護(hù)豬只，特別是使通過母乳被動免疫的新生仔豬免受病毒感染。因此，從疫苗免疫上看，弱毒疫苗的免疫效果要好于滅活疫苗。相比弱毒疫苗，滅活苗免疫產(chǎn)生抗體時間慢，而且只能誘導(dǎo)體液免疫；而弱毒疫苗產(chǎn)生抗體快，相比滅活苗產(chǎn)生免疫保護(hù)時間短，免疫保護(hù)力高。但從免疫持續(xù)期看，滅活苗要比弱毒疫苗長，受抗體干擾小。因此，在防疫過程中，特別是清群凈化階段或提高免疫持續(xù)期，使用滅活苗會是不錯的選擇。

臨床發(fā)現(xiàn)，初產(chǎn)母豬往往發(fā)病率高于經(jīng)產(chǎn)母豬，初產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率和死亡率也往往高于經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率和死亡率；這在于初產(chǎn)母豬自身產(chǎn)生的腹瀉免疫力較弱，體內(nèi)未產(chǎn)生足夠高腹瀉抗體，不足以給仔豬提供母源性保護(hù)。

3.2 母乳被動免疫是保護(hù)新生仔豬的關(guān)鍵

由于此次病毒性腹瀉主要引起10日齡內(nèi)新生哺乳仔豬的高發(fā)病和高死亡，如何使新生仔豬獲得保護(hù)力是防控的關(guān)鍵。新生仔豬感染腹瀉病毒的主動免疫存在主要問題為：1）在陽性母豬群，母源抗體干擾口服弱毒疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)；2）新生哺乳仔豬免疫系統(tǒng)不成熟；3）需要3周的時間才能產(chǎn)生抗體，但PEDV的高毒力和早期感染使得仔豬不具備自身產(chǎn)生抗體來抵抗感染。因此，通過接種疫苗對仔豬進(jìn)行主動免疫來保護(hù)新生仔豬免受感染和發(fā)病在臨床上不可行，被動的母乳免疫是其獲得可能保護(hù)的有效手段。因此，在懷孕母豬黏膜部位誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，通過初乳和乳汁被動轉(zhuǎn)移給仔豬，提供給仔豬腸道感染的直接保護(hù)作用至關(guān)重要。先前對于TGEV被動免疫的研究表明，感染TGEV康復(fù)的母豬能夠提供給其后代豬群針對TGEV感染的保護(hù)，這種保護(hù)與乳汁中高水平的抗體息息相關(guān)。因此，以免疫過母豬的乳汁被動免疫保護(hù)新生哺乳仔豬被感染是最有效和可行的方法。實際上，為了促進(jìn)仔豬的健康，每一個仔豬出生后必須盡早吃初乳。因為初乳中大量的IgG和IgA 在被仔豬攝取1 h后可以通過小腸吸收，這稱為“腸封閉”，為了獲得大量的IgG 和IgA，每1頭小豬必須在出生2 h內(nèi)中攝取到初乳。這是因為在大約2 h左右，母豬初乳中IgG和IgA的量達(dá)到最高水平，這個水平能持續(xù)6 h，此后乳中IgG和IgA 的數(shù)量急劇下降。因此，盡早讓新生仔豬吃到初乳，且吃到充足的初乳是仔豬抵抗腹瀉病毒感染的關(guān)鍵。

3.3 不同免疫方法的臨床效果

臨床上雖然使用了較多的疫苗，但腹瀉的發(fā)生仍然態(tài)勢嚴(yán)峻。免疫方法的不同可獲得不同的結(jié)果。在未發(fā)生過腹瀉的豬場，單純的免疫滅活苗或弱毒苗都未能在腹瀉暴發(fā)時保持較好的抵抗力，而往往是需要將弱毒苗與滅活苗結(jié)合使用才能獲得較好的保護(hù)力。因為單純的免疫滅活苗經(jīng)非口途徑免疫不能誘導(dǎo)黏膜免疫，在血清和初乳中主要是系統(tǒng)性的IgG 抗體占主導(dǎo)地位，其在乳汁中很快下降，提供給仔豬微不足道（很?。┑娜橹庖?。在免疫母豬所產(chǎn)仔豬 TGEV 攻毒保護(hù)研究中，如果疫苗在母豬腸道中誘導(dǎo)主動免疫失敗，母豬發(fā)病，表現(xiàn)腹瀉或食欲減退和停止乳汁產(chǎn)生，哺乳仔豬表現(xiàn)高死亡率。因此，誘導(dǎo)有效黏膜免疫的TGEV或PEDV母源疫苗對于保護(hù)母豬腸道是至關(guān)重要的。而單純的免疫弱毒株免疫母豬較強(qiáng)毒株免疫母豬產(chǎn)生較低的乳汁sIgA抗體水平和仔豬保護(hù)率，導(dǎo)致差異原因包括疫苗中較低的病毒量和胃腸道穩(wěn)態(tài)的喪失，以及病毒致弱后在母豬腸道復(fù)制能力。

臨床上還發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)過腹瀉的豬場，特別是母豬發(fā)生腹瀉的豬接種滅活苗的防控效果較好。究其原因是暴發(fā)的過程相當(dāng)于自然感染或口服病毒，能夠很好地誘導(dǎo)腸道黏膜免疫，再接種滅活苗后能夠進(jìn)一步刺激產(chǎn)生更高水平的抗體，特別是IgG，以提供全身性免疫?；诖私?jīng)驗，有很多的養(yǎng)殖場嘗試采用人工感染的方法——即返飼，然后再結(jié)合疫苗來進(jìn)行防控。有學(xué)者比較了返飼、疫苗接種與返飼+接種疫苗后母豬血清及乳汁中抗體水平差異，發(fā)現(xiàn)提前感染可促進(jìn)疫苗免疫后抗體的產(chǎn)生。在產(chǎn)前6周和3周分別注射PEDV RNA疫苗，不管是后備母豬還是經(jīng)產(chǎn)母豬的血液和乳汁中只有低水平或可忽略的IgG和中和抗體滴度；產(chǎn)前4個月返飼可從乳汁中檢出高滴度的中和抗體，但未從血清中檢出IgG；在進(jìn)行連續(xù)3 d返飼的種豬母乳和血清中均可檢出IgG和中和抗體；而在返飼+接種疫苗的豬群中均有高滴度的血清IgG和乳汁中和抗體，且經(jīng)受住了一次PEDV暴發(fā)。據(jù)此可知，經(jīng)口暴露或口服免疫能很好地促進(jìn)乳汁中高滴度中和抗體的產(chǎn)生，這可為以母乳獲得被動免疫的新生哺乳仔豬提供很好的保護(hù)。

但返飼存在較多的風(fēng)險：1）返飼的劑量大小對返飼效果和副作用之間的平衡是臨床上非常難把握的，劑量小了豬只不腹瀉，達(dá)不到返飼的目的；劑量大了可能造成母豬流產(chǎn)腸內(nèi)病毒載量過高而導(dǎo)致大面積腹瀉。2）發(fā)病豬除了感染了腹瀉病毒，還可能攜帶其他的病毒，如偽狂犬病毒、豬藍(lán)耳病病毒或圓環(huán)病毒等，伴隨著返飼這些病毒可在全場傳播，從而可能造成新的疾病出現(xiàn)。因此，返飼是一種風(fēng)險較高的手段，需要結(jié)合實驗室評估以獲得準(zhǔn)確腹瀉病毒定量以及排除其他可能的傳染性病原后才可實施。

參考文獻(xiàn)略，如有所需請與作者聯(lián)系。