宗慶華 婁永利 張 輝 王世帥

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450007)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus memb- ran- aceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus (Bge.)Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.]的干燥根，其主要成分為黃芪多糖，具有提高機(jī)體免疫能力、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗衰老、修復(fù)神經(jīng)損傷、降低腦缺血損傷、調(diào)節(jié)血糖、治療糖尿病等藥理作用[1]。益生菌具有改善機(jī)體代謝，促進(jìn)腸道有益菌增殖和增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能[2]。有研究表明，生藥黃芪經(jīng)益生菌發(fā)酵后，黃芪多糖的成分含量顯著提高，且能提高機(jī)體免疫功能[3,4]。腦損傷是當(dāng)今威脅人類生命的最主要的腦科疾病之一，腦損傷后容易出現(xiàn)免疫抑制，降低機(jī)體對(duì)外界的抗感染能力。腦損傷破壞血腦屏障，導(dǎo)致機(jī)體受到強(qiáng)烈刺激，大量的免疫細(xì)胞滲透入腦組織，引起免疫反應(yīng)，伴隨著腦內(nèi)各種炎癥因子如TNF- α、IL- 1β的分泌及上調(diào)[5,6]。前人的研究多集中于西藥對(duì)腦損傷的免疫保護(hù)作用，但對(duì)中藥相關(guān)方面的研究較少[7,8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，利用益生菌FGM發(fā)酵黃芪，并提取發(fā)酵黃芪多糖，通過測(cè)定脾臟、胸腺指數(shù)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力和TNF- α、IL- 1β的表達(dá)，探討其對(duì)腦損傷小鼠免疫功能的影響，為益生菌發(fā)酵對(duì)黃芪多糖藥理作用變化的研究，以及黃芪藥材在腦損傷疾病的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠40只，8周齡，體重18～22 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，采用隨機(jī)化分組法分為假手術(shù)組，模型組，發(fā)酵黃芪多糖高、中、低濃度給藥組，每組8只。

1.1.2儀器和試劑 BT25S型電子天平(德國賽多利斯公司)；全自動(dòng)發(fā)酵罐(上海百侖生物科技有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(寧波市雙嘉儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；HH- S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；XS225A型分析天平(瑞士普利賽斯有限公司)；無水葡萄糖對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司)；蒽酮(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；硫酸(廣州化學(xué)試劑廠)；乙醇為分析純，水為純水。MRS肉湯培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；2,3,5- 氯化三苯基四氮唑(TTC)、刀豆蛋白(ConA)、噻唑藍(lán)(MTT)均購自美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO，江蘇永健化工有限公司)； ELISA試劑盒(Biolegend公司)；益生菌FGM為非解乳糖鏈球菌，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分離；黃芪藥材購自廣州市清平市場，經(jīng)鑒定為豆科植物膜莢黃芪[Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.]的干燥根。

1.2方法

1.2.1黃芪藥材的發(fā)酵[9]復(fù)蘇凍存益生菌FGM菌株，取2 ml培養(yǎng)液于100 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下厭氧培育24 h，為第一代菌株；再取第一代菌株培養(yǎng)液2 ml于100 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下厭氧培育24 h，為第二代菌株；按上述方法培育至第四代。發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌后加入自動(dòng)發(fā)酵罐中，接種第四代FGM菌株，接菌量為5%，調(diào)節(jié)pH為7.4，于37℃下200 r/min發(fā)酵2 d。將發(fā)酵液放入真空冷凍干燥機(jī)中，凍干后得到發(fā)酵黃芪發(fā)酵粉。

1.2.2黃芪多糖的提取 取黃芪發(fā)酵粉100 g，加水1 000 ml加熱回流30 min，濾過，于濾液中加入3倍體積95%乙醇，搖勻，靜置24 h，于4 500 r/min離心15 min，棄上清，重復(fù)上述步驟，得到發(fā)酵黃芪多糖。

1.2.3黃芪多糖的含量測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取葡萄糖對(duì)照品20 mg，于100 ml容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，配制成0.2 mg/ml的溶液，分別精密吸取1、2、3、4、5 ml于10 ml容量瓶中，加水定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取黃芪多糖10 mg，于100 ml容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，得到供試品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液、供試品溶液1.0 ml，分別置于10 ml具塞試管中，將試管置于冰水中，分別向試管中加入0.2%蒽酮- 硫酸溶液4 ml，搖勻，2 min后置于沸水浴中加熱10 min，取出冰浴迅速冷卻，室溫下放置10 min，于620 nm處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。把供試品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中多糖的含量。

1.2.4給藥方法與動(dòng)物模型的建立[10]發(fā)酵黃芪多糖高、中、低濃度給藥組小鼠在造模前7天每天于固定時(shí)間腹腔注射劑量分別為200、100、50 mg/kg的發(fā)酵黃芪多糖，最后一次給藥1 h后建立腦損傷模型。假手術(shù)組和模型組小鼠注射等體積的生理鹽水。除假手術(shù)組外，其余組小鼠以3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定于消毒手術(shù)臺(tái)上。頸部正中切口，暴露頜下腺。鈍性分離頸部肌肉組織使左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)分離，結(jié)扎并游離ECA主干一段。結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端。在ECA上剪一小口，將制備好的尼龍線栓通過ECA插入ICA，緩慢推進(jìn)約1 cm至大腦前動(dòng)脈。缺血2 h后，抽出線栓再灌注24 h。假手術(shù)組不插入尼龍線，其余步驟相同。造模成功10 min后開放雙側(cè)頸動(dòng)脈開始再灌注，縫合切口，再灌注24 h。

1.2.5脾臟和胸腺指數(shù)的測(cè)定 將小鼠用頸椎脫臼法處死后，稱量小鼠體重，于生物安全柜中分離小鼠脾臟和胸腺，取出，分別稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)；胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.2.6脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 取小鼠頸椎脫臼處死，無菌環(huán)境下取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×106個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，設(shè)12個(gè)復(fù)孔，其中前6孔加入5 μl ConA(0.1 mg/ml)，另外6孔不加ConA。置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μl DMSO，置搖床上低速振蕩15 min，使紫色結(jié)晶完全溶解；靜置，在酶檢儀579 nm波長處測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力=實(shí)驗(yàn)孔OD值-對(duì)照孔OD值[11]。

1.2.7TNF- α、IL- 1β的測(cè)定 損傷后24 h將小鼠斷頭處死，于冰臺(tái)上迅速取下大腦，制備腦組織勻漿，采用ELISA檢測(cè)損傷側(cè)大腦勻漿中炎癥因子TNF- α和IL- 1β的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1黃芪多糖含量測(cè)定結(jié)果 以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)X，吸光度A為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸處理，得到回歸方程Y=8.4X+0.044，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2，表明線性關(guān)系在0.02～0.08 mg之間，線性關(guān)系良好。見圖1。把供試品測(cè)得的吸光度代入回歸方程計(jì)算黃芪多糖含量，得到黃芪多糖含量為3.25%。

2.2對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，發(fā)酵黃芪多糖的低、中、高濃度給藥組均能使小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。假手術(shù)組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與高濃度給藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3腦組織切片TTC染色 染色后，正常小鼠的腦組織染成紅色，缺血腦梗死區(qū)域腦組織呈蒼白色。結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠的腦組織切片均被染紅，模型組白色梗死范圍最大，低、中、高濃度給藥組的梗死灶有不同程度的減輕。與模型組相比，低、中、高濃度給藥組小鼠腦梗死范圍顯著減少(P<0.05)。

圖1 葡萄糖對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose control solution

2.4脾淋巴細(xì)胞增殖 模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，與模型組相比，高、中、低給藥組小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)，假手術(shù)組小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力與高濃度給藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.5抑制炎癥因子的表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠TNF- α和IL- 1β的表達(dá)水平存在顯著差異，與模型組相比，高、中、低給藥組小鼠的TNF- α和IL- 1β表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，假手術(shù)組小鼠的TNF- α與中、高濃度給藥組小鼠相比不存在顯著差異(P>0.05)，假手術(shù)組小鼠的IL- 1β含量與高濃度給藥組小鼠相比不存在顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表1小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(n=8)

Tab.1Spleenindexandthymusindexofmice(n=8)

GroupsSpleenindexThymusindexSham-operatedgroup9.47±0.822.62±0.13Modelgroup6.45±0.541)1.28±0.151)Highconcentrationadministrationgroup7.67±0.542)2.13±0.072)Mediumconcentrationadministrationgroup8.07±0.572)2.39±0.062)Lowconcentrationadministrationgroup8.77±0.562)2.54±0.112)

Note：Compared with Sham- operated group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

表2小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況(n=8)

Tab.2Proliferationofspleniclymphocytesinmice(n=8)

GroupsODvalueSham-operatedgroup0.81±0.04Modelgroup0.45±0.051)Highconcentrationadministrationgroup0.66±0.082)Mediumconcentrationadministrationgroup0.77±0.032)Lowconcentrationadministrationgroup0.80±0.052)

Note：Compared with Sham- operated group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

表3小鼠炎癥因子表達(dá)水平(n=8)

Tab.3Expressionlevelsofinflammatoryfactorsinmice(n=8)

Note：Compared with Sham- operated group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

3 討論

通過微生物發(fā)酵中藥，可利用微生物中的酶，在溫和的條件下發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到增強(qiáng)藥效，降低副作用的目的。益生菌是良好的免疫激活劑，能夠通過提高巨噬細(xì)胞的活性，提高機(jī)體的免疫能力和抗感染能力。益生菌FGM為非解乳糖鏈球菌，安全無毒，是能夠發(fā)酵黃芪，提高多糖提取率的益生菌。本研究結(jié)果表明，益生菌FGM發(fā)酵黃芪多糖能夠通過增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、有效降低炎癥反應(yīng)來提高腦損傷小鼠的免疫能力，對(duì)腦損傷造成的免疫抑制具有一定的修復(fù)作用。

脾淋巴細(xì)胞增殖能力可以反映出體內(nèi)細(xì)胞的免疫能力，測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是研究腦損傷小鼠免疫能力的重要指標(biāo)。MTT法穩(wěn)定客觀，沒有放射性損傷和污染問題，可用于測(cè)定腦損傷小鼠脾淋巴增殖能力[12]。本實(shí)驗(yàn)通過刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖，用MTT法測(cè)定腦損傷小鼠脾淋巴增殖能力。結(jié)果表明，發(fā)酵黃芪多糖能顯著增強(qiáng)腦損傷小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力。腦損傷后會(huì)引起腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥因子的表達(dá)水平會(huì)持續(xù)升高。TNF- α、IL- 1β在腦損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中作為反應(yīng)早期的炎癥細(xì)胞因子，參與腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡及死亡，在腦損傷中起主導(dǎo)作用[13,14]。TNF- α、IL- 1β促進(jìn)炎癥介質(zhì)生產(chǎn)，如上調(diào)細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)，破壞血腦屏障，造成腦水腫，促進(jìn)過度炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)自由基的釋放，增強(qiáng)興奮性氨基酸毒性，進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵黃芪多糖能有效降低腦損傷小鼠的TNF- α、IL- 1β水平，說明發(fā)酵黃芪多糖能通過緩解炎癥反應(yīng)起到免疫保護(hù)作用。

本研究對(duì)發(fā)酵黃芪多糖促進(jìn)腦損傷小鼠免疫作用的有效劑量進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)低、中、高濃度給藥組均可顯著提高模型組小鼠的免疫能力，高劑量組能使腦損傷小鼠的免疫能力恢復(fù)正常水平。本次實(shí)驗(yàn)并未考察發(fā)酵黃芪多糖的準(zhǔn)確作用時(shí)間段，望以后的研究中對(duì)此加以改進(jìn)。

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