王學耀 韓秋菊 張 建

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所，濟南 250012)

NF- κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞中多種生理過程，不僅廣泛參與機體的應激反應、炎癥反應，還與T、B淋巴細胞的發(fā)育分化及活化過程密切相關(guān)，具有復雜的調(diào)節(jié)機制[1]。目前已證實NF- κB可高效誘導IL- 6、TNF- α等多種細胞因子的產(chǎn)生。在細胞質(zhì)內(nèi)，NF- κB與抑制性蛋白IκB結(jié)合形成無活性的復合物；當細胞受到細胞因子刺激或者發(fā)生感染等情況時，抑制性蛋白IκB發(fā)生磷酸化，隨著構(gòu)象改變使得NF- κB脫落，活化的NF- κB進入細胞核，并與DNA結(jié)合，最終啟動或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[1,2]。IκB及NF- κB不僅能夠調(diào)控炎癥應答，調(diào)控組織損傷，還與免疫細胞的發(fā)育分化以及遷移過程密切相關(guān)。研究表明，Th17細胞的發(fā)育與IκB成員有關(guān)，并且NF- κB還能調(diào)控Treg細胞、DC等的發(fā)育分化過程[3- 5]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟作為免疫器官的觀點已經(jīng)被廣泛接受，主要包括固有免疫及適應性免疫系統(tǒng)，并且其固有免疫應答占優(yōu)勢地位，在抵御外來病原體入侵過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。而NF- κB信號通路在多種肝臟疾病如酒精性肝炎、病毒性肝炎、肝纖維化以及肝癌等的進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，NF- κB在病毒性肝炎的早期可以通過Fas依賴的途徑，促進肝細胞的凋亡；肝纖維化過程中NF- κB的活化可促進炎癥細胞因子的分泌，增強肝星狀細胞(HSC)的增殖以及活化，促進細胞外基質(zhì)(ECM)的形成，從而加重纖維化進程。同時，NK細胞、NKT細胞、T細胞作為肝臟免疫中關(guān)鍵的細胞亞群，在肝損傷過程中發(fā)揮重要的作用。有文獻報道表達TRAIL分子的NK細胞對肝細胞具有強烈的細胞毒活性[8]。日本科學家Takeda等[9]發(fā)現(xiàn)，NKT缺陷的CD1d基因敲除小鼠可以抵抗Con A誘導的肝臟損傷。此外，在NKT細胞缺陷Vl4-/-小鼠也觀察到類似的實驗結(jié)果[10]。而藥物誘導的肝損傷模型中，肝臟中CD8+T細胞的浸潤增多，其可進一步殺死肝細胞，加重肝損傷[11,12]。

然而，NF- κB信號通路對肝臟淋巴細胞不同亞群以及表型的影響研究較少。本文以IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，該小鼠表達IκBα分子的突變型，其可耐受磷酸化，而不易發(fā)生降解，因此該小鼠經(jīng)典NF- κB信號通路處于抑制狀態(tài)[13，14]。本文旨在初步分析NF- κB信號通路對肝臟淋巴細胞亞群比例、凋亡狀態(tài)以及表型的影響，為后期深入探討NF- κB信號通路對肝臟區(qū)域免疫的調(diào)控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠 該實驗在哈佛醫(yī)學院Beth Israel Deaconess醫(yī)學中心開展，該轉(zhuǎn)基因小鼠由芝加哥大學惠贈[8,9]。

1.1.2試劑 RPMI1640購于Gibco公司；anti- CD3、anti- NK1.1、Annexin V購自eBioscience 公司；Annexin V/PI試劑盒購自eBioscience公司；SYBR Green Mix購自羅氏公司。

1.2方法

1.2.1肝臟單個核細胞提取 摘眼球放血，脫頸椎處死解剖小鼠，取出肝臟，放置于含有1×PBS的培養(yǎng)板中；將肝臟置于200目篩網(wǎng)上，用眼科剪刀剪碎、研磨，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，700 r/min離心1 min，離心完畢后將上清收集于另一干凈離心管；每管加入適量1×PBS，使細胞充分懸起，1 500 r/min離心6 min，棄上清；每管加入現(xiàn)配置的40% percoll分離液，每管5 ml，充分懸起細胞，2 500 r/min離心25 min，離心棄上清；每管加入3 ml紅細胞裂解液，使細胞充分懸起，4℃放置10 min；加入適量1×PBS，1 500 r/min棄上清；每管加入500 μl左右1×PBS充分懸起細胞，即得小鼠肝臟單個核細胞。

1.2.2流式細胞術(shù) 每管加入100 μl 1×PBS，并加入20 μl 大鼠血清，4℃封閉30 min；設置陰性對照和單標組，實驗組分別加入檢測抗體，輕輕混勻，4℃避光放置1 h；每管加入適量1×PBS，1 500 r/min離心6 min，離心棄上清；加入適量1×PBS充分懸起細胞，于流式細胞儀進行檢測；并用流式軟件進行分析。

1.2.3Annexin V法檢測細胞凋亡 將肝臟單個核細胞用1×PBS清洗一遍，200 μl Annexin V結(jié)合液重懸細胞，混勻，每管加入2.5 μl Annexin V- FTIC染液，4℃避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.4熒光定量PCR 參照Trizol說明書，提取肝臟組織總RNA。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行PCR反應，均為實驗室常規(guī)檢測手段。檢測基因包括CCL2、IFN- γ、IL- 2及IL- 15，定量PCR體系如表1所示。

1.3統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用配對t檢驗。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01認為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟呈現(xiàn)損傷狀態(tài) IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟處于損傷狀態(tài)，如圖1A的HE染色結(jié)果顯示，野生型小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，無壞死灶。而IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟具有明顯的壞死灶，肝索結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞(圖1B)。這一結(jié)果表明，在IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠中，盡管NF- κB信號通路發(fā)生抑制，仍然導致嚴重的肝臟損傷。

表1熒光定量PCR體系

Tab.1Quantitativereal-timePCRsystem

ConstituentVolume2×SYBRGreenMix8μlForwardprimer2μlReverseprimer2μlcDNA4μlTotalsystem16μl

圖1 IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟呈現(xiàn)損傷狀態(tài)Fig.1 Liver injury was observed in IκBα- tg mice

2.2IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟多個淋巴細胞亞群比例下降 為研究NF- κB信號通路對肝臟NK、T、NKT細胞亞群比例的影響，采用流式細胞術(shù)對上述淋巴細胞亞群進行了分析。結(jié)果如圖2所示，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠NK細胞降至(9.03±2.3)%、T細胞降至(21.96±4.5)%、NKT細胞降至(3.2±1.9)%。這一結(jié)果表明，NF- κB信號通路對肝臟多個淋巴細胞亞群維持有重要作用。

2.3IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞凋亡增多 為研究NF- κB對肝臟NK、T、NKT細胞亞群凋亡狀態(tài)的影響，采用Annexin V標記法檢測上述淋巴細胞的凋亡狀態(tài)。結(jié)果如圖3A所示，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠NK細胞凋亡比例顯著增加，這與IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞亞群比例下降的結(jié)果相吻合。然而，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠T細胞凋亡比例并沒有顯著變化(圖3B)。這一結(jié)果表明，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠NK細胞數(shù)量下降可能與其易凋亡有關(guān)，而T細胞比例下降的原因需進一步分析。

2.4IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞表型分析 為進一步研究IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中NK細胞表型，我們提取小鼠肝臟單個核細胞，F(xiàn)ACS分析NKG2A和NKp46的表達水平。結(jié)果如圖4A顯示，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠中NKG2A陽性率并沒有顯著改變，其平均熒光強度有下降的趨勢。此外，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞表面NKp46顯著下降，見圖4B。這一結(jié)果表明，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞表型發(fā)生改變，可能會影響NK細胞功能。

圖2 IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟多個淋巴細胞亞群比例下降Fig.2 Several immune subsets were decreased in IκBα- tg miceNote: *.P<0.05.

2.5IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細胞因子譜發(fā)生改變 為進一步研究IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷是否與炎癥因子表達改變有關(guān)，提取野生型和IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織，定量PCR檢測細胞因子和趨化因子的表達。結(jié)果如圖5A顯示，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠中CCL2表達顯著降低；并且，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠中IFN- γ表達含量亦顯著下降(圖5B)。然而，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠中IL- 2和IL- 15的含量并沒有顯著變化，見圖5C、D。這一結(jié)果表明，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細胞因子譜發(fā)生改變。

圖3 IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞凋亡增多Fig.3 Percentage of apoptotic NK cells was increased in IκBα- tg miceNote: *.P<0.05.

圖4 IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞表型分析Fig.4 Phenotype of NK cells in IκBα- tg miceNote: *.P<0.05.

圖5 IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細胞因子譜發(fā)生改變Fig.5 Cytokine profile in liver from IκBα- tg miceNote: *.P<0.05.

3 討論

NF- κB作為重要的信號調(diào)控通路，不僅參與炎癥、腫瘤發(fā)生等過程，還與免疫細胞的發(fā)育、維持密切相關(guān)。因此，全面分析IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中不同亞群的比例、表型和功能可以進一步明確NF- κB信號通路在肝臟區(qū)域免疫中發(fā)揮的重要作用。

我們在實驗中觀察到IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷情況較為嚴重。盡管多數(shù)文獻報道稱，肝臟損傷與NF- κB信號通路活化以及其下游的TNF- α、IL- 6升高有關(guān)[15- 17]。但是也有文獻認為，抑制NF- κB信號通路可以促進肝臟損傷尤其是肝細胞凋亡[18,19]。造成這一矛盾現(xiàn)象的原因較為復雜，可能與肝臟損傷模型、肝臟損傷階段、小鼠品系有關(guān)。也可能是小鼠過表達IκBα的過程中，激活了其他與炎癥相關(guān)的信號通路，而造成小鼠肝臟損傷。這也體現(xiàn)了，NF- κB信號通路在肝臟損傷的不同階段扮演不同角色。

本研究表明，與野生型小鼠相比，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞、T細胞及NKT細胞的比例均顯著降低。這與另外一種NF- κB信號通路活化小鼠模型中觀察到的現(xiàn)象比較類似[19]。我們分析認為，由于IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞凋亡比例較高，可能導致其比例有所下降。而T細胞和NKT細胞的凋亡比例在兩組小鼠之間并沒有顯著性差異，可能由于細胞的增殖能力或存活有所不同,也有可能與T細胞和NKT細胞在肝臟部位的募集有關(guān)，如CXCL9可募集NK細胞，而CXCL10可募集T細胞，具體的原因有待我們進一步分析[20]。

我們的實驗中觀察到，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中CCL2表達水平顯著降低，其主要參與單核細胞的募集，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中單核細胞的相關(guān)功能值得我們進一步分析。我們還觀察到，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織IFN- γ表達顯著下降，提示我們這一分子的表達一定程度上依賴NF- κB信號通路。這一結(jié)果與文獻報道相一致，IκBα被認為能通過STAT4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控IFN- γ的表達[21]。

綜上所述，IκBα轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織形態(tài)、免疫細胞亞群比例、表型及細胞因子譜均發(fā)生改變。這些結(jié)果提示，IκBα和NF- κB信號通路在肝臟免疫應答中扮演重要角色。本研究成果為進一步研究NK- κB信號如何影響肝臟免疫的形成和維持提供了重要的理論基礎。

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