周凱凱，張 勝，趙 忠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

古樹(shù)名木是活的歷史檔案，是自然和先民留給我們的珍貴遺產(chǎn)，對(duì)于弘揚(yáng)中華傳統(tǒng)文化、發(fā)展創(chuàng)意產(chǎn)業(yè)、建設(shè)生態(tài)文明具有不可估量的價(jià)值。因此開(kāi)展古樹(shù)衰退(衰老)的研究，揭示古樹(shù)衰老機(jī)理對(duì)于制定科學(xué)的保護(hù)措施十分重要[1-3]。

銀杏(Ginkgobiloba)是我國(guó)古樹(shù)中重要的樹(shù)種，在黃河流域廣泛分布[4]。目前，古樹(shù)的研究主要集中在組織培養(yǎng)、抗氧化系統(tǒng)酶活性及脅迫響應(yīng)等方面[5-7]，但是，在分子水平上有關(guān)銀杏抗衰老與抗逆調(diào)控的研究很少。

蛋白質(zhì)既是生命活動(dòng)的承擔(dān)者又是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，所有生命體都由蛋白質(zhì)承擔(dān)性狀表達(dá)功能，所以通過(guò)研究不同樹(shù)齡階段的蛋白表達(dá)特征差異，有助于揭示樹(shù)木衰老的分子機(jī)理，對(duì)深化古樹(shù)保護(hù)研究具有重要的意義[8-11]。雙向電泳技術(shù)是利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量這2個(gè)維度的特性分離蛋白質(zhì)群的技術(shù)[12]，主要來(lái)分析和比較蛋白質(zhì)的差異表達(dá)[13]。目前基于雙向電泳技術(shù)(2-DE)與質(zhì)譜(MS)鑒定相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究植物發(fā)育過(guò)程和響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的有力工具，在研究植物葉片衰老和脅迫響應(yīng)方面已有很多報(bào)道。比如R.Gupta[14]等利用2-DE技術(shù)研究大豆葉片自然衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在葉片衰老過(guò)程中，與茉莉酸生物合成和與防御相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度特異性增加，而與光合作用和ROS清除相關(guān)的蛋白質(zhì)減少，其中茉莉酸在大豆葉片衰老過(guò)程中扮演著重要的作用。X.D.Wei[15]等利用2-DE技術(shù)研究銀杏葉片在自然衰老過(guò)程中葉綠體蛋白的差異表達(dá)，質(zhì)譜鑒定的15個(gè)差異蛋白點(diǎn)主要與植物光合作用、轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞次生代謝和活性氧(ROS)清除有關(guān)[15]。

本研究以陜西省周至縣樓觀臺(tái)老子手植銀杏(約2 600年生)、說(shuō)經(jīng)臺(tái)銀杏古樹(shù)(約800年生)和20年生銀杏為研究對(duì)象，利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分離差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過(guò)MALDI TOF/TOF MS/MS技術(shù)及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定差異蛋白種類(lèi)并進(jìn)行功能分類(lèi)，討論了這些蛋白質(zhì)可能參與的植物細(xì)胞代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016年7月分別從老子手植銀杏(約2 600年生)、說(shuō)經(jīng)臺(tái)銀杏古樹(shù)(約800年生)和20年生幼齡銀杏的樹(shù)冠中層向陽(yáng)處采集健康的葉片，用蒸餾水清洗，錫箔紙包好后迅速投入液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本試驗(yàn)所用兩性電解質(zhì)(Bio-Lyte 4-6、5-7)、預(yù)制IPG膠條(線(xiàn)性17 cm，pH 4～7)均購(gòu)于Bio-Rad公司，其他試劑均為分析純。

1.2 蛋白質(zhì)的提取

參照W.Wang[16]等的方法，利用SDS-苯酚法提取蛋白質(zhì)，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 蛋白質(zhì)的溶解和定量

將充分干燥的蛋白質(zhì)沉淀溶解在裂解緩沖液中[含7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4%CHAPS(w/v)，1%DTT(w/v)，0.25%Bio-Lyte 4-6(v/v)和0.25%Bio-Lyte 5-7(v/v)][17]。

根據(jù)M.M.Bradford[18]法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，使用天艮Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用分光光度計(jì)測(cè)定λ=595 nm時(shí)每個(gè)蛋白樣品的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

1.4 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳

第一向等電聚焦(IEF)：利用PROTAIN IEF Cell等電聚焦儀((Bio-Rad)在固定的pH梯度(IPG)膠條(pH 4～7，17 cm)進(jìn)行等電聚焦。每個(gè)樣品蛋白上樣量為600 μg，與水化上樣緩沖液[8 mol·L-1尿素，4%CHAPS(w/v)，0.001%溴酚藍(lán)，1%DTT(w/v)，0.25%Bio-Lyte 4-6(v/v)和0.25%Bio-Lyte 5-7(v/v)]充分混合至上樣體系為400 μL，將其加入聚焦槽中，使IPG膠條膠面朝下置于樣品溶液上，確保膠條與電極緊密接觸并在其上加適量礦物油。等電聚焦在20℃下進(jìn)行，具體程序見(jiàn)表1[19-20]。

表1 銀杏葉片蛋白質(zhì)17 cm膠條等電聚焦程序設(shè)置Table 1 Program of isoelectric focusing of total protein of Ginkgo leaves with 17 cm IPG strips

第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：在等電聚焦結(jié)束之后，將IPG膠條放入已盛有5 mL平衡緩沖液Ⅰ(6 mol·L-1尿素，2%SDS，0.375 mol·L-1Tris-HCl，20%甘油和2% DTT)的溶脹盤(pán)中平衡15 min，期間不斷搖晃；用5 mL平衡緩沖液Ⅱ(6 M尿素，2%SDS，0.375 M Tris-HCl，20%甘油和2.5%碘乙酰胺)平衡15 min后，用1 x電極緩沖液沖洗平衡后的IPG膠條，使用濾紙將凝膠條上的多余液體輕輕吸干[21-23]，將IPG膠條置于垂直12%聚丙烯酰胺凝膠的頂部，使IPG膠條與分離膠緊密接觸并加入1%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。將SDS-PAGE 膠架放入PROTAIN IEF Cell 型電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)中，加入1 x電極緩沖液，接通冷卻水，在10 mA·gel-1的恒定電流下電泳約30 min，待溴酚藍(lán)指示線(xiàn)走出IPG膠條后，調(diào)大電流(30 mA·gel-1)電泳至指示線(xiàn)達(dá)到底部邊緣時(shí)停止[24-25]。

1.5 凝膠染色、圖像掃描及分析

雙向電泳結(jié)束后，將凝膠取出放入固定液(50%乙醇，10%乙酸)中固定1 h，然后利用考馬斯亮藍(lán)G-250染液(10%硫酸銨，10%磷酸，20%乙醇，0.12%G-250)在搖床上過(guò)夜染色。染色結(jié)束后，將凝膠放入脫色液(5%乙醇，5%乙酸)中搖晃，可多次進(jìn)行脫色至凝膠背景色變白[26-27]。

使用PowerLook 2100XL掃描儀掃描凝膠獲得圖像(400 dpi，全彩)并保存為T(mén)IFF文件，將圖像導(dǎo)入PDQuest 8.0軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行分析[28-29]，主要涉及蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、凝膠匹配、蛋白分子量及等電點(diǎn)的計(jì)算和蛋白的相對(duì)定量。

1.6 質(zhì)譜鑒定及功能注釋

將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切下送至上海中科新生命生物科技有限公司、采用5800 MALDI-TOF/TOF/質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[30]，對(duì)鑒定成功的蛋白點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳圖譜分析

本試驗(yàn)分別從老子手植銀杏、說(shuō)經(jīng)臺(tái)銀杏及幼齡銀杏的葉片中檢測(cè)到340、341和410個(gè)肉眼可辨、點(diǎn)形規(guī)則清晰、可重復(fù)的蛋白點(diǎn)(圖1)。以幼齡銀杏為對(duì)照，在老子手植銀杏中檢測(cè)到差異蛋白點(diǎn)(豐度變化>1.5倍，可信度95%)87個(gè)，其中豐度上調(diào)蛋白點(diǎn)24個(gè)，下調(diào)蛋白點(diǎn)63個(gè)；在說(shuō)經(jīng)臺(tái)銀杏中檢測(cè)到差異蛋白點(diǎn)(豐度變化>1.5倍，可信度95%)130個(gè)，其中豐度上調(diào)蛋白點(diǎn)33個(gè)，下調(diào)蛋白點(diǎn)97個(gè)?？梢钥闯觯S著銀杏年齡的增長(zhǎng)，大多數(shù)差異蛋白的豐度下降而少部分差異蛋白豐度上升。

分析幼齡銀杏葉片雙向電泳圖譜(圖1-C)中410個(gè)蛋白點(diǎn)的分子量及等電點(diǎn)，結(jié)果顯示：銀杏葉片中的蛋白點(diǎn)分子質(zhì)量大多分布在20～50 kDa(占70%，圖2-A)，而蛋白的等電點(diǎn)主要集中分布在pH 5～6.5(占75%，圖2-B)，大多數(shù)這樣的蛋白點(diǎn)都可以利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，但考慮到考馬斯亮藍(lán)蛋白染色方法的靈敏度有限，所以最終選擇質(zhì)譜鑒定的都是高表達(dá)的蛋白點(diǎn)。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析

利用PD-Quest軟件分析，從凝膠上切出差異蛋白點(diǎn)37個(gè)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF MS和MS/MS鑒定，成功鑒定了30個(gè)蛋白點(diǎn)(圖1中標(biāo)注的蛋白點(diǎn))，分別在NCBI-Acro gymnospermae中檢索到11個(gè)、在Uniprot-Viridiplantae中檢索到19個(gè)蛋白點(diǎn)的信息，詳細(xì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出，在這30個(gè)蛋白點(diǎn)中，有5個(gè)蛋白點(diǎn)是Rubisco活化酶蛋白種類(lèi)或Rubisco的大、小亞基，分別是蛋白點(diǎn)4 205、7 614、5 802、3 204、3 325；3個(gè)蛋白點(diǎn)是烏頭酸水合酶(蛋白點(diǎn)8 801、7 801、7 802)，各有2個(gè)蛋白點(diǎn)是Clp蛋白酶(5 701和6 803)、70 ku熱休克蛋白(3 702和3 701)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(7 204和8 202)，這些蛋白都參與了植物重要的生理生化代謝途徑，包括光合作用、脅迫響應(yīng)、能量和碳水化合物代謝等。

2.3 蛋白功能分類(lèi)

通過(guò)GO功能注釋可以將成功鑒定的蛋白質(zhì)分為8個(gè)功能類(lèi)別(圖3)，最多的是與能量及碳水化合物代謝有關(guān)的蛋白(40%)，其他依次是與蛋白及氨基酸合成代謝有關(guān)的蛋白(20%)、光合作用(16.7%)、次生代謝(6.7%)、脅迫響應(yīng)(6.7%)、脂質(zhì)代謝(3.3%)、轉(zhuǎn)錄起始因子(3.3%)、未知(3.3%)。這個(gè)結(jié)果表明，參與能量及碳水化合物代謝、蛋白及氨基酸合成代謝和光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)種類(lèi)與銀杏的年齡變化關(guān)系密切。

2.4 差異蛋白聚類(lèi)分析

以幼齡銀杏(圖4中Age-1)作為對(duì)照，將成功鑒定的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行分層聚類(lèi)，使具有相似豐度變化模式的蛋白質(zhì)分在同一組中，可以得到不同年齡的銀杏葉片蛋白點(diǎn)豐度變化的綜合概述。通過(guò)聚類(lèi)分析，可將30個(gè)蛋白點(diǎn)分為4組，Ⅰ組中包含2個(gè)蛋白質(zhì)，均在幼齡銀杏中表達(dá)量最高，在中齡銀杏(Age-2)中表達(dá)量最低，而在老齡銀杏(Age-3)中表達(dá)量略低于幼齡銀杏，這2個(gè)蛋白質(zhì)分別是HSP 70和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)，主要與植物的應(yīng)激反應(yīng)和光合作用有關(guān)；Ⅱ組中包含的8個(gè)蛋白質(zhì)都隨著銀杏年齡的增大表達(dá)量降低，分別參與植物的能量及碳水化合物代謝(3個(gè))、蛋白及氨基酸合成代謝(2個(gè))、次生代謝(2個(gè))和應(yīng)激反應(yīng)(1個(gè))；Ⅲ組中包括7個(gè)蛋白質(zhì)，均在中齡銀杏中表達(dá)量最低，其中4個(gè)在老齡銀杏中上調(diào)表達(dá)，3個(gè)在老齡銀杏中的表達(dá)量略低于幼齡銀杏，主要參與植物的能量及碳水化合物代謝(6個(gè))和蛋白質(zhì)水解(1個(gè))；Ⅳ組中包含的11個(gè)蛋白質(zhì)，除了蛋白點(diǎn)8907在老齡銀杏中未檢測(cè)到，其余10個(gè)均隨著銀杏年齡的增長(zhǎng)其表達(dá)量顯著升高，其中3個(gè)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)參與植物光合作用，3個(gè)參與蛋白質(zhì)及氨基酸代謝的分別是谷氨酰胺合成酶、谷氨酸氨連接酶、甘氨酸脫羧酶，其他分別參與能量及碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等途徑。

圖1 不同年齡銀杏葉片雙向電泳圖(A-2600 a，B-800 a，C-20 a)Fig.1 2-DE gels of leaf extracts from Ginkgo with 2600 (A),800 (B) and 20 (C) years of age

3 結(jié)論與討論

本研究利用2-DE聯(lián)合MALDI TOF/TOF MS/MS技術(shù)研究樓觀臺(tái)不同樹(shù)齡銀杏的葉片蛋白差異表達(dá)，初步從蛋白水平揭示了銀杏響應(yīng)年齡變化的機(jī)制，差異蛋白主要參與植物能量及碳水化合物代謝、蛋白及氨基酸合成代謝及光合作用等，說(shuō)明銀杏在響應(yīng)年齡變化的過(guò)程中，首先加強(qiáng)蛋白及氨基酸合成代謝并以能量代謝及光合作用等途徑來(lái)調(diào)節(jié)自身反應(yīng)。本研究明確了不同年齡銀杏葉片差異蛋白參與的代謝途徑，為進(jìn)一步從分子水平深入了解銀杏抗衰老的機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

銀杏樹(shù)作為地球“活化石”，是最古老的植物，那么不同年齡階段的銀杏其蛋白表達(dá)是否有差異，這些差異主要表現(xiàn)在哪些方面呢？本研究利用雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的技術(shù)分析了3個(gè)年齡銀杏葉片的蛋白質(zhì)差異表達(dá)，蛋白質(zhì)功能分析表明，差異蛋白主要參與植物的能量及碳水化合物代謝、光合作用和蛋白及氨基酸合成代謝等途徑。

圖2 銀杏葉片蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分布圖Fig.2 Molecular weight and isoelectric point distribution of proteins from Ginkgo leaves

圖3 差異蛋白功能分類(lèi)

在植物體內(nèi)，能量及碳水化合物代謝始終伴隨著各種物質(zhì)代謝進(jìn)行，是一個(gè)極其復(fù)雜、綜合調(diào)控的過(guò)程。在本次研究中，3-磷酸甘油醛脫氫酶(蛋白點(diǎn)7 204和8 202)、烏頭酸水合酶(蛋白點(diǎn)7 802、8 801及7 801)等是直接參與能量代謝的重要酶類(lèi)。作為細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)組成性表達(dá)的蛋白質(zhì)，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)主要參與糖酵解途徑，可以催化3-磷酸甘油醛脫氫和磷酸化，生成1,3-二磷酸甘油酸同時(shí)為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖代謝起著重要的作用[31-32]，本研究發(fā)現(xiàn)其在幼齡銀杏葉中豐度表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于老年銀杏，說(shuō)明在幼齡銀杏葉片中的能量代謝更為旺盛。在本研究中有3個(gè)凝膠位置檢測(cè)到同一個(gè)蛋白質(zhì)——烏頭酸水合酶(7 802、8 801和7 801)，可能是由蛋白質(zhì)翻譯后修飾、同一基因的不同拷貝或蛋白質(zhì)降解所引起的位置變化，在以前的研究中也報(bào)道了類(lèi)似的位置變化[33]。烏頭酸水合酶是參與植物細(xì)胞線(xiàn)粒體三羧酸循環(huán)中重要的輔酶，其在幼齡銀杏葉片中的表達(dá)高于中、老年銀杏，說(shuō)明幼齡銀杏葉片中三羧酸循環(huán)活動(dòng)強(qiáng)于中、老年銀杏，而這一規(guī)律在動(dòng)物細(xì)胞中也得到證實(shí)，葉薇[34]等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠細(xì)胞衰老過(guò)程中，烏頭酸水合酶活性下降，繼而使三羧酸循環(huán)效率及細(xì)胞能量合成降低。

圖4 不同樹(shù)齡銀杏葉片差異蛋白聚類(lèi)分析

SpotNo.蛋白描述蛋白得分檢索號(hào)理論分子量PI/ku實(shí)驗(yàn)分子量PI/ku被鑒定肽段覆蓋率/%相匹配的肽鏈片段數(shù)能量及碳水化合物代謝72043磷酸甘油醛脫氫酶327tr|A0A164V0V147.99/7.5722.87/6.6147%1782023磷酸甘油醛脫氫酶(片段)164tr|A0A078JPL942.6/5.5923.39/6.5621%62605ATP合成酶亞基1110AEX98990.155.48/5.0232.23/5.1143%223330I果糖-1,6-二磷酸酶254tr|A8VYM044.11/5.2427.01/5.5329%85602琥珀酸脫氫酶237AIZ74343.169.49/6.2537.39/5.8829%123205磷酸核酮糖激酶260tr|A0A0C9RW0544.71/6.2823.55/5.4250%167802烏頭酸水合酶163tr|A0A059ASC998.17/5.8961.17/6.4122%208801烏頭酸水合酶179tr|A0A0E0K8H7106.19/6.6861.05/6.4914%117801烏頭酸水合酶87tr|A0A0D3A1P097.99/6.0261.27/6.3815%126301(3-ketoacyl-coathiolase)乙酰輔酶A205tr|Q0837548.48/8.6626.59/6.0319%67102異檸檬酸脫氫酶171tr|A0A0D6QS5841.45/7.120.78/6.433%104602ATP合成酶209tr|A0A0C9RQ4468.39/5.2438.48/5.590.4317光合作用5802核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(葉綠體)97AAR23418.146.71/6.4259.34/5.7123%104205核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶亞型214AHL24664.148.4/6.4922.86/5.5528%127614核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(葉綠體)561AFJ39054.152.7/640.79/6.4454%193204核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶亞型194AHL24663.152.74/5.8922.83/5.4429%123325核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶亞型171AHL24664.148.4/6.4927.08/5.4619%10蛋白及氨基酸合成代謝5204谷氨酸-氨連接酶204CAA52448.139.5/6.4223.6/5.7520%65701依賴(lài)ATP葉綠體伴侶蛋白244tr|A0A088F9I1100.62/6.1751.74/5.7625%136803伴侶蛋白clpB2325tr|A0A151T007100.22/5.6358.83/5.8830%208907甘氨酸分解酶類(lèi)152JAG87694.1112.97/6.7183.72/6.727%175203谷氨酰胺合成酶205CCO25538.139.18/5.7423.37/5.8814%43605FTSH2依賴(lài)ATP鋅金屬蛋白酶400tr|W9RHR974.2/5.9437.31/5.4834%18脅迫響應(yīng)3702熱激蛋白70479tr|A0A0K9Q1T971.52/5.0740.46/5.2640%173701熱激蛋白70619tr|A0A0A0KXG370.83/5.1740.69/5.2856%25次生代謝8601甲酸-四氫葉酸連接酶87tr|A0A0V0IPT653.53/6.6139.41/6.4610%37009異黃酮還原酶936AGG40646.133.27/6.1618.59/6.5770%15脂質(zhì)代謝86042-羥基酰輔酶A裂解酶122tr|M7YG5236.61/5.2134.65/6.6624%7轉(zhuǎn)錄起始因子5310轉(zhuǎn)錄起始因子eIF-4A家族425tr|A9P85146.84/5.3828.16/5.7146%13未知7105醛酮還原酶157tr|E4MVL238.1/5.920/6.422%7

光合作用對(duì)于綠色植物來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的，本研究發(fā)現(xiàn)與光合作用密切相關(guān)的、在植物葉片中含量最高的[14](50%～70%)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的表達(dá)量在不同年齡的銀杏中有極大的差異。蛋白點(diǎn)5 802、3 204、3 325、4 205和7 614均是RuBisCO，而且除了點(diǎn)5 802外的4個(gè)蛋白點(diǎn)均在中、老年銀杏葉片中的表達(dá)量顯著高于幼齡銀杏中，說(shuō)明在中、老年銀杏中的光合作用強(qiáng)度>幼齡銀杏。RuBisCO在植物遭受逆境時(shí)也表現(xiàn)出很重要的作用，Z.Sheng[35]等研究發(fā)現(xiàn)古側(cè)柏在遭受低溫脅迫時(shí)光合作用明顯降低，而幼齡側(cè)柏中RuBisCO表達(dá)量顯著>古側(cè)柏以保證其光合效率；大量研究發(fā)現(xiàn)，植物在遭受高溫脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的RuBisCO多肽，說(shuō)明極端條件下RuBisCO在維持植物的光合速率中發(fā)揮著重要的作用[36]。

植物對(duì)氮素(N)的吸收利用能力是決定其生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要因素，而谷氨酰胺合成酶(GS)是綠色植物在氮同化代謝途徑中重要的酶類(lèi)，它可以催化游離態(tài)銨離子同化成谷氨酰胺，后者在其他酶類(lèi)的催化作用下生成谷氨酸[37]。在本研究中，谷氨酰胺合成酶(蛋白點(diǎn)5 203)在中、老年銀杏中表達(dá)量分別是幼齡銀杏中的2.8倍和3.3倍，說(shuō)明在中老年銀杏中氮素同化效率更高。目前，對(duì)于GS的研究主要集中在其在不同植物組織中特異性表達(dá)、在整個(gè)氮素代謝過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能方面[38]，而且H.C.Thomsen[39]等研究發(fā)現(xiàn)GS1同源體的過(guò)表達(dá)并不能提高植物的氮素利用效率，因?yàn)镚S活性可以通過(guò)機(jī)制鏈下調(diào)，強(qiáng)烈地受環(huán)境條件和潛在的代謝失調(diào)的影響[39]。

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