蔣英俊

(安徽省合肥市第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230032)

再生障礙性貧血表現(xiàn)為外周血全血細胞減少和骨髓穿刺造血細胞三系減少，是常見的骨髓衰竭性血液系統(tǒng)疾病，T淋巴細胞免疫紊亂是再生障礙性貧血發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制細胞毒性T細胞，上調(diào)輔助性T細胞和造血正調(diào)控因子表達，下調(diào)造血負(fù)調(diào)抗因子，治療再生障礙性貧血具有肯定療效[2]。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，再生障礙性貧血與腎臟、脾臟、肝臟關(guān)系密切，采用辨證施治效果較好[3]。2012年1月—2015年12月，筆者采用補腎生血湯聯(lián)合間充質(zhì)細胞治療再生障礙性貧血患者43例，療效較好，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇上述時期我院血液科收治的再生障礙性貧血患者86例，均經(jīng)血常規(guī)、網(wǎng)織紅細胞、骨髓形態(tài)及活檢等檢查確診，符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中慢性再生障礙性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并符合腎虛血瘀型的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[5]：面色萎黃，唇甲淡白，頭暈，耳鳴，心悸，氣短乏力，健忘，腰膝酸軟，日久不愈，皮膚可見紫褐色出血點或瘀斑，齒、鼻衄，血色暗，舌質(zhì)暗淡，或有瘀斑，或有瘀點，脈細或細澀；經(jīng)規(guī)范免疫抑制治療≥12個月無效，無條件行造血干細胞移植；年齡18～70歲，性別不限；患者對研究知情并簽署知情同意書。排除嚴(yán)重肝、腎功能障礙及伴急性傳染病者，重型再生障礙性貧血合并嚴(yán)重感染未控者，孕婦、哺乳期婦女，對中藥過敏者，惡性腫瘤者，合并陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、骨髓增生異常綜合征、急性造血功能停滯、骨髓纖維化、急性白血病、惡性組織細胞病等可引起全血細胞減少疾病者，精神疾病者。隨機分為2組：對照組43例，男24例，女19例；年齡(49.72±11.02)歲；病程(23.63±18.41)個月。研究組43例，男21例，女22例；年齡(50.24±10.84)歲；病程(25.27±17.05)個月。2組性別、年齡、病程比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法 2組親緣供者經(jīng)健康體檢合格后，嚴(yán)格遵循無菌原則，采集肝素抗凝骨髓40 mL，送至細胞中心分離、培養(yǎng)。對照組給予表面抗原鑒定和微生物檢測合格的第3～5代骨髓間充質(zhì)細胞回輸，每次輸注細胞數(shù)1×106kg-1，每周輸注1次，共治療4周，治療期間停用免疫抑制劑，加強防治感染、出血。研究組在對照組治療基礎(chǔ)上給予補腎生血湯治療，組成：制首烏12 g、熟地9 g、女貞子15 g、當(dāng)歸10 g、菟絲子15 g、仙靈脾15 g、補骨脂9 g、黨參30 g、丹參15 g、茜草9 g、阿膠10 g(燉化)、鹿角膠10 g(燉化)、巴戟天15 g，出血重者加蒲黃10 g，水煎至200 mL，早晚分服，1劑/d，連續(xù)服用4周。

1.3觀察指標(biāo) ①治療前后抽取患者靜脈血，檢測血常規(guī)[血紅蛋白(Hb)、白細胞(WBC)、血小板(Plt)、中性粒細胞、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度]、T淋巴細胞亞群水平。②治療前后抽取患者骨髓，檢測骨髓象、骨髓血清堿性成纖維生長因子(bFGF)、骨髓微血管密度(MVD)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。MVD和VEGF采用SP法進行免疫組織化學(xué)檢測。MVD計數(shù)方法：每張切片先在低倍(100 倍) 視野鏡中選出血管最豐富的3 個區(qū)域，然后在400 倍視野下計數(shù)微血管3次，取平均值，凡被CD34 免疫組織化學(xué)染色染成棕色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇的，均作為1個血管計數(shù)。VEGF檢測：顯色主要定位于細胞的胞漿，部分細胞膜可見顯色，陽性為棕黃色或棕褐色，光學(xué)顯微鏡高倍視野下計數(shù)200 個有核細胞，計數(shù)陽性細胞百分率。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后血常規(guī)比較 2組治療前Hb、WBC、Plt、中性粒細胞、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后Hb、WBC、Plt和中性粒細胞均顯著升高(P均<0.05)，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均顯著降低(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.22組治療前后T淋巴細胞亞群比較 2組治療前CD8+、CD4+、CD4+CD25+FoxP3+、CD3+CD4+INF-γ+、CD3+CD4+IL-4+和Th1/Th2比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后CD8+、CD3+CD4+IL-17+、CD3+CD4+INF-γ+、Th1/Th2水平均顯著降低(P均<0.05)，CD4+、CD4+CD25+Foxp3+和CD3+CD4+IL-4+均顯著升高(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 2組治療前后血常規(guī)比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

表2 2組治療前后T淋巴細胞亞群比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.32組治療前后骨髓象比較 治療前2組骨髓增生程度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后骨髓增生活躍率均顯著升高(P均<0.05)，非造血細胞百分率均顯著降低(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表3。

2.42組治療前后骨髓bFGF、MVD和VEGF比較2組治療前bFGF、MVD、VEGF水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后bFGF、MVD、VEGF均顯著升高(P均<0.05)，且研究組明顯高于對照組(P均<0.05)。見表4。

表3 2組治療前后骨髓增生程度比較 例(%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

3 討 論

隨著研究的進展，越來越多的學(xué)者認(rèn)為再生障礙性貧血是以造血細胞為靶細胞的自身免疫性疾病，免疫抑制劑治療有效為此提供了直接證據(jù)[6]。

表4 2組治療前后骨髓bFGF、MVD和VEGF比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

正常機體內(nèi)T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)取決于CD4+和CD8+T細胞平衡，而再生障礙性貧血患者體內(nèi)存在T淋巴細胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為T細胞增多和功能活化，外周血CD4+比例減少，CD8+升高，CD4+/CD8+比值降低，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。CD4+是再生障礙性貧血的重要驅(qū)動者和參與者，CD4+包括Th1細胞(CD4+INF+T細胞)、Th2細胞(CD4+IL-4+T細胞)、Treg、Th17細胞(CD4+IL-17+T細胞)，這些細胞在分化和功能上相互拮抗，在再生障礙性貧血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Treg細胞是具有獨特免疫調(diào)節(jié)作用的T細胞，可抑制T細胞的活化和增殖，F(xiàn)oxp3是Treg的轉(zhuǎn)錄因子，控制Treg細胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育和成熟及Treg細胞功能的發(fā)揮，再生性障礙貧血患者外周血和骨髓Foxp3表達均顯著降低[8]。體內(nèi)未知抗原可誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th1細胞偏移分化，而Th2細胞代償不足，導(dǎo)致Th1/Th2比例升高，最終導(dǎo)致下游效應(yīng)因子和效應(yīng)細胞顯著升高，造成骨髓造血功能衰竭[9]。Th17細胞可分泌特異性細胞因子IL-17，功能上與Treg細胞相拮抗，在機體免疫防御和穩(wěn)定維護中發(fā)揮重要作用，Th17/Treg失衡參與再生障礙性貧血的發(fā)病，患者Th17細胞數(shù)量增多且與Treg細胞呈負(fù)相關(guān)，治療緩解者Th17細胞表達較治療前顯著降低[10]。

骨髓微血管系統(tǒng)生成與造血微環(huán)境密切相關(guān)，造血微環(huán)境改變是再生障礙性貧血病理生理變化的重要環(huán)節(jié)，bFGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖，增加血管通透性，是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化的生長因子之一，且是特異性促進新生血管形成的生成因子，骨髓bFGF水平與再生障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。VEGF是作用最強的促血管生成因子之一，在維持血管密度方面發(fā)揮積極作用，MVD改變和VEGF下調(diào)對再生障礙性貧血的病理生理過程有協(xié)同作用，再生障礙性貧血患者骨髓MVD、VEGF顯著降低，且與病情緩解程度呈正比[12]。

中醫(yī)無“再生障礙性貧血”之病名，多根據(jù)其貧血、發(fā)熱、衄血等臨床癥狀歸于“虛勞”“虛損”“血虛”“血證”等范疇，認(rèn)為其發(fā)病臟腑主要為心、肝、脾、腎，其中又以腎為根本，“腎主骨生髓”，“腎藏精”，“精血互化”，腎精虧虛，骨髓失于充養(yǎng)，不能化生氣血，而見面色萎黃、唇甲淡白、心悸、氣短、乏力，腦失滋養(yǎng)而見耳鳴、頭暈、健忘，骨髓空虛，腰府失養(yǎng)，而見腰膝酸軟，氣虛無力推動血脈運行，血虛則血行不暢，而致血瘀，或離經(jīng)之血不去，瘀阻絡(luò)脈，而見皮膚瘀斑或瘀點，離經(jīng)之血謂之壞血，其色紫暗，瘀血不去，新血不生，故病情纏綿難愈，所以腎精虧虛、氣血不足、瘀血內(nèi)阻是再生障礙性貧血的重要病機，治宜補腎生血，活血化瘀。本研究采用自擬補腎生血湯方中制首烏、熟地、女貞子、當(dāng)歸、阿膠、鹿角膠滋陰補血，填精生髓；菟絲子、仙靈脾、補骨脂、巴戟天溫補腎陽；黨參補氣；丹參、茜草活血化瘀、生血止血，補血不留瘀、行血而不傷正；諸藥合用可兼補腎陰、腎陽，填精益血，祛瘀生新。胡令彥等[13]研究顯示，補腎中藥可調(diào)節(jié)免疫功能紊亂，保護血細胞，刺激骨髓造血功能。孫鳳等[14]研究顯示，補腎生血中藥可協(xié)調(diào)Th17細胞mRNA表達水平，調(diào)整異常免疫反應(yīng)，恢復(fù)骨髓的造血細胞。董玢等[15]研究顯示，補腎生血中藥可激活EPO/EPOR信號途徑，抑制Th1活化誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，恢復(fù)骨髓造血干細胞功能。

本研究結(jié)果顯示，研究組治療后CD8+、CD4+、CD4+CD25+FoxP3+、CD3+CD4+INF-γ+、CD3+CD4+IL-4+、Th1/Th2、血常規(guī)和骨髓象改善情況均明顯優(yōu)于對照組，骨髓bFGF、MVD和VEGF水平高于對照組。結(jié)果說明補腎生血湯聯(lián)合間充質(zhì)細胞治療再生障礙性貧血可調(diào)整機體免疫功能紊亂和改善骨髓造血微環(huán)境，詳細機制尚有待進一步研究。

[1] 何亞利，梁順容，鐘一梅. T淋巴細胞亞群與炎性因子在評估再生障礙性貧血病情及預(yù)后中的應(yīng)用[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36(17)：2516-2518

[2] 李罡燦，宋艷萍，張韻潔，等. 間充質(zhì)干細胞對再生障礙性貧血患者造血支持及T淋巴細胞分泌功能的影響[J]. 中國組織工程研究，2016，21(1)：107-112

[3] 張彥麗，成玉斌，杜欣，等. 中醫(yī)藥治療再生障礙性貧血文獻分析[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，31(5)：990-992

[4] 劉秋爽，黃國清，程永紅. 骨髓間充質(zhì)干細胞對再生障礙性貧血患者體內(nèi)T細胞活化影響的臨床分析與研究[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(6)：409-410

[5] 李如輝. 中西醫(yī)結(jié)合?？撇≡\療大系·血液病學(xué)[M]. 太原：山西科學(xué)技術(shù)出版社，1997：71-108

[6] 劉海蕓，劉婷婷. 再生障礙性貧血發(fā)病機制研究進展[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2015，23(4)：1216-1220

[7] 付茹婷，薛紅漫，徐宏貴，等. r-ATG聯(lián)合CsA治療兒童再生障礙性貧血的療效分析[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2013，21(2)：426-430

[8] 王西閣，王曉格，欒斌，等． 調(diào)節(jié)性T細胞及Foxp3基因在再生障礙性貧血患兒外周血中的變化及意義[J]． 中國當(dāng)代兒科雜志，2010，12(4)：241-243

[9] 伊冬梅，許洪志，張婧瑤，等. AA、MDS和AML患者CD4+T細胞亞群的變化及臨床意義[J]. 山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，50(3)：67-78

[10] 史洋溢. 調(diào)節(jié)性T細胞/Th17細胞失衡在血液系統(tǒng)疾病發(fā)病中的作用[J]. 國際兒科雜志，2013，40(4)：402-405

[11] 鄭雪晨，楊琦，臧婷婷，等. 補腎活髓顆粒對慢性再生障礙性貧血患者骨髓血清中bFGF 的影響[J]. 新中醫(yī)，2014，46(11)：108-111

[12] 楊方方，王康瑋，向琪，等. 復(fù)方皂礬丸對慢性再生障礙性貧血骨髓MVD、VEGF的影響[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2015，23(2)：477-480

[13] 胡令彥，胡明輝，周永明，等. 補腎法對再生障礙性貧血療效及對Th17/Treg相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平的影響[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38(2)：1-5

[14] 孫鳳，雍彥禮，王金環(huán)，等. 補髓生血顆粒治療慢性再生障礙性貧血的療效及對Th17 細胞和IL-23 的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36(7)：885-887

[15] 董玢，劉涓，婁利霞，等. 補腎生血解毒方對再生障礙性貧血小鼠紅細胞生成相關(guān)細胞因子表達的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，37(6)：397-400;409