李京濤，魏海梁，閆曙光，郭 輝，鞠 迪，史曉燕，常占杰

(1. 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2. 陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000)

肝癌是臨床常見消化道惡性腫瘤，其具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、病死率高等特點，臨床上以手術(shù)治療為主、放化療結(jié)合為輔的綜合治療雖然有一定療效，但仍然存在預后差、復發(fā)率高等缺點。肝癌前病變是指從肝硬化發(fā)展成為肝癌的中間階段，肝細胞的重度非典型腺瘤樣增生和變異肝細胞結(jié)節(jié)與肝癌的發(fā)生關(guān)系最為密切，若能提前干預肝癌前病變的發(fā)展，將可逆轉(zhuǎn)肝癌的發(fā)生[1-2]。前期研究顯示，益脾養(yǎng)肝方可能具有預防肝癌前病變的作用[3-4]，但其機制不明。本實驗觀察了益脾養(yǎng)肝方對二乙基亞硝胺(DENA)誘導的肝癌前病變大鼠肝功能、血清炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及組織病理學的影響，旨在探討該方的作用機制，為其臨床應用提供依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 選取SPF級Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，均購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(軍)-2012-0007，飼料購于西安交通大學實驗動物中心，飼養(yǎng)在陜西中醫(yī)藥大學實驗中心。

1.2實驗試劑和藥品 DENA(0.95 g/mL，美國Sigma公司)；IL-6和TNF-α試劑盒(南京森貝伽生物有限公司)；益脾養(yǎng)肝方：由白術(shù)、黨參、熟地、鱉甲、枸杞、半枝蓮、郁金、姜黃、白花蛇舌草組成，藥材均統(tǒng)一由陜西中醫(yī)藥大學藥劑科購買并制備成凍干粉，每克凍干粉的生藥含量為5 g,4 ℃冰箱密封保存，需要時以100 ℃沸水溶解，配制成大劑量濃度為1.0 g/mL、小劑量濃度為0.5 g/mL的中藥藥液。

1.3動物分組、造模及干預 將80只喂養(yǎng)1周的 Wistar雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、益脾養(yǎng)肝方小劑量組、益脾養(yǎng)肝方大劑量組，每組20只。除空白組外，其余組均給予DENA(0.5 mL/100 g)腹腔注射，2次/周(即1次/84 h)， 50 mg/(kg·周)，連續(xù)給藥至16周；在此過程中，益脾養(yǎng)肝方小、大劑量組分別給予0.5 g/mL和1.0 g/mL益脾養(yǎng)肝方灌胃，空白組、模型組給予生理鹽水灌胃，均10 mL/kg，1次/d，第16周灌胃24 h后處死大鼠。

1.4取材及指標測定 處死大鼠前稱體質(zhì)量。采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，心臟采血注入2支EDTA管中，將血標本分為2份，一份送陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院生化檢驗科檢測肝功能指標(ALT、AST、GGT)，另一份離心后提取血清用于檢測IL-6、TNF-α水平(按照ELISA試劑盒說明操作)；再解剖腹腔，完整取出肝臟，分別于肝左葉、右葉、尾葉取材并置于4%甲醛溶液中固定,常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，以方差分析進行組間比較，方差齊者采用單因素方差分析中的LSD進行檢驗，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較 模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和益脾養(yǎng)肝方大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于小劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與益脾養(yǎng)肝方小劑量組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 模型組血清IL-6和TNF-α水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和益脾養(yǎng)肝方大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均明顯低于小劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與益脾養(yǎng)肝方小劑量組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟組織病理表現(xiàn) 空白組大鼠肝臟實質(zhì)細胞排列比較整齊，圍繞著中央靜脈形成“輻輳”樣分布，肝實質(zhì)細胞胞漿均勻紅染，胞核居于中央，核膜完整，肝小葉內(nèi)未見明顯異常成分存在，匯管區(qū)動靜脈、小膽管結(jié)構(gòu)清晰，未見內(nèi)皮細胞水腫和炎癥細胞向肝臟實質(zhì)內(nèi)浸潤。模型組大鼠肝實質(zhì)細胞水腫變形，胞內(nèi)脂肪沉積，局部肝實質(zhì)細胞壞死，匯管區(qū)膽管擴張，膽汁淤積，同時毛細膽管大量增生；肝實質(zhì)細胞核體積腫大，伴見細胞核分裂呈多形性，同時伴有異型增生和結(jié)節(jié)形成，排列紊亂，增生膠原纖維條索破壞形成假小葉，淋巴細胞向肝竇內(nèi)和匯管區(qū)移行。益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組肝細胞異型增生和核分裂相均較模型組減少，肝實質(zhì)細胞很少發(fā)生變性和壞死，淋巴細胞向匯管區(qū)和肝竇內(nèi)的浸潤顯著減少。見圖1～4。

圖1 空白組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖2 模型組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3 益脾養(yǎng)肝方小劑量組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖4 益脾養(yǎng)肝方大劑量組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

3 討 論

肝炎到肝癌的形成過程比較漫長，而肝癌前病變是從肝硬化發(fā)展為肝癌之間一個不可逾越的過程，如果能夠提前阻止肝癌前病變的形成過程，可延緩或阻斷病情發(fā)展，顯著降低肝癌的發(fā)生率。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中對肝癌前病變雖沒有明確的概念，但中醫(yī)自古有“既病防變”的理念。益脾養(yǎng)肝方是我院沿用多年的中藥復方，方中熟地黃補腎滋陰，枸杞益陰養(yǎng)肝；白術(shù)健脾益氣；黨參補中益氣生血，助運脾胃，達到后天得養(yǎng)、血氣得充之目的；郁金行氣化瘀，氣行則血行；姜黃合鱉甲散瘀行氣，消積散結(jié)；白花蛇舌草合半枝蓮消癰散結(jié)，清解熱毒。全方具有養(yǎng)肝健脾、活血行氣、解毒消炎之功。現(xiàn)代藥理學研究表明，白術(shù)揮發(fā)油可提升小腸推進率，降低胃內(nèi)殘留率，進而發(fā)揮促進胃腸蠕動的功效[5]；而白術(shù)內(nèi)酯I可抑制黑色素瘤A875活性，可調(diào)整細胞周期，促進細胞凋亡，減少腫瘤微血管的形成，起到抗腫瘤作用[6]。鱉甲活性多肽可抑制小鼠肝纖維化模型中肝功指標、纖維化指標的升高,促進超氧化物歧化酶(SOD)、金屬基質(zhì)蛋白酶-1(MMP-1)的合成，進而起到保護肝細胞、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用[7]；半枝蓮可通過降低實驗性肝癌組織中ADAM10陽性表達率來抑制原發(fā)性肝癌形成[8]，而半枝蓮醇提取物可通過阻止NF-κB誘導的炎癥相關(guān)因子IL-6、IFN-γ等的釋放，促進肝臟谷胱甘肽的表達而發(fā)揮保肝作用[9]。白花蛇舌草揮發(fā)油可抑制HeGP2細胞活力，使細胞體積變小、變圓、核固縮、細胞內(nèi)空泡變多等，抑制細胞生長[10]。白花蛇舌草總黃酮可抑制胃癌BGC-823細胞株DNA復制，阻滯細胞增殖周期，促進細胞凋亡；同時其可抑制CLIC4蛋白的表達和TGF-β1介導腫瘤相關(guān)成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于模型組，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組各指標水平均明顯低于小劑量組；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組大鼠肝臟病變明顯輕于模型組。提示益脾養(yǎng)肝方可改善肝功能，抑制肝癌前病變的進展。

肝癌前病變的形成過程與炎癥反應密切相關(guān)，炎癥性微環(huán)境在介導整個肝癌的形成過程中發(fā)揮著“推動力”的作用，炎癥因子則是推動肝臟炎癥反應的有力“執(zhí)行者”。TNF-α作為促炎因子，可通過介導NF-κB途徑激活肝星狀細胞，同時NF-κB的活化可促進IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β等的表達，起到放大炎癥反應的作用[12-13]。IL-6可促進B細胞增殖和細胞毒性T淋巴細胞活化，使Kupffer細胞受損和觸發(fā)炎癥反應[14]；且IL-6與IL-6Ra結(jié)合使PI3K活化，PIP2被磷酸化為PIP3，其通過間接或直接途徑激活Akt，進而促進肝癌進展[15-16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯增高，益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均大幅降低，且大劑量組明顯低于小劑量組。提示益脾養(yǎng)肝方可抑制肝臟炎癥反應。

綜上所述，益脾養(yǎng)肝方可抑制肝癌前病變的進展，其可能是通過降低炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平，繼而發(fā)揮抑制肝臟炎癥反應，降低炎性微環(huán)境對肝實質(zhì)細胞的持續(xù)刺激作用來實現(xiàn)的。本實驗為益脾養(yǎng)肝方在臨床推廣應用提供了一定的理論基礎。

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