許 潔,王紅旗,孔德康 (北京師范大學水科學研究院,北京 100875)

多環(huán)芳烴(PAHs)是持久性有機污染物(POPs)的典型代表,它是由2個或2個以上的苯環(huán)以線性,彎接或簇聚的方式稠和在一起的化合物[1].PAHs有“三致”效應(致畸、致癌、致突變),給生態(tài)環(huán)境、人類和其他生物體的健康帶來極大危害;還有較高的穩(wěn)定性和疏水性、脂溶性,生物利用性較低.因此 PAHs成為污染土壤修復的難點之一.

差異蛋白質組學是通過尋找各種因素引起的蛋白質表達差異,以解釋細胞生理和病理機制,即主要通過比較分析不同狀態(tài)下或近似物種間蛋白質的表達圖譜,實現(xiàn)對體系內代謝調控的動態(tài)監(jiān)測,從而揭示機體對內外界環(huán)境變化產生反應的本質規(guī)律.同位素相對和絕對定量技術(iTRAQ)是 2004年美國應用生物系統(tǒng)公司(AB SCIEX)推出的一項體外同位素蛋白質定量標記技術[2-3],可以高通量分析生物樣本中的蛋白及其表達情況,通過比較不同樣本之間的差異蛋白,全面系統(tǒng)地揭示生理過程的變化.在醫(yī)學應用方面,施旭俊等[4]在研究海分枝桿菌野生株和mkl突變株的全菌蛋白差異時,采用iTRAQ技術發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白566個,其中上調232個,下調334個,主要參與細菌脂質代謝、細胞壁和細胞進程、中間代謝、呼吸作用等生物學過程.其中 DesA3下調最顯著,其功能為脂肪酸去飽和酶,與油酸合成相關.朱傳智[5]以結核分枝桿菌臨床分離鏈霉素敏感株01105和結核分枝桿菌H37Rv為對照,采用 iTRAQ 技術分析結核分枝桿菌臨床分離鏈霉素耐藥株01108菌體的耐藥相關潛在蛋白,01108菌株分別與01105菌株和H37Rv菌株比較差異表達蛋白為194和146個,共同差異表達蛋白為121個,其生物進程主要參與中間代謝, 呼吸作用和脂質代謝;分子功能主要為催化活性功能和結合功能.在發(fā)酵工程方面,林小瓊[6]在研究高效表達木聚糖酶重組畢赤酵母細胞時,采用iTRAQ技術對3組甲醇誘導產酶菌株分析,得到352個差異蛋白.在低表達菌株 G1中,上調蛋白主要參與能量和物質代謝,以及氨基酸代謝,這些途徑為外源蛋白的表達提供能量和物質供給.在高表達菌株 G4中,內質網(wǎng)蛋白折疊和加工相關蛋白上調,氨基酸代謝和甲醇代謝相關蛋白下調.過量表達剪切后的HAC1菌株G4-H中,激活UPR機制,參與核糖體蛋白表達的蛋白表達降低.

本文采用 iTRAQ蛋白分離技術并結合LC-MS/MS鑒定紅球菌BAP-1在熒蒽連續(xù)誘導下的蛋白差異表達,并對差異蛋白進行生物信息學的蛋白功能調控分析,進而從分子生物學角度闡明PAHs降解菌的關鍵蛋白和代謝的微觀機理,以期為微生物修復土壤中PAHs這一棘手問題提供理論基礎和實踐指導.

1 材料與方法

1.1 菌種培養(yǎng)

紅球菌BAP-1是本課題組前期從天津濱海濕地石油污染地區(qū)篩選得到的包氣帶高效多環(huán)芳烴降解菌株.BAP-1首先經(jīng)過LB擴大培養(yǎng)36h后,轉接入3mg/L熒蒽的選擇性培養(yǎng)基中,25℃、110r/min進行搖瓶誘導實驗.

1.2 試劑和儀器

1.2.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：5g酵母提取物,10g牛肉蛋白胨,10g NaCl(鹽度為1%),加去離子水定容到1L,121℃高壓蒸汽滅菌20min.

無機鹽培養(yǎng)基(MSM)： 4gNa2HPO4, 1.5gKH2PO4,1gNH4Cl, 1gNaNO3, 200mgMgSO4·7H2O, 20mgCaCl2,30mgFeSO4·7H2O, 1mL微量元素,10g NaCl(鹽度1%),加去離子水定容到1L,121℃高壓蒸汽滅菌20min.其中微量元素的配方為(1L)： 2.5mgCoCl2·6H2O,3.7mg(NH4)6Mo7O24·4H2O,40mgCuSO4·5H2O,57mgH3BO3, 43mgMnSO4·5H2O, 43mgZnSO4·7H2O.

選擇性無機鹽培養(yǎng)基：在已滅菌的 MSM 中加入一定量的熒蒽丙酮溶液,使其達到 3mg/L,待丙酮揮發(fā)2h后使用.

1.2.2 實驗儀器 LC-20AB液相色譜(島津),LC-20AD納升液相色譜儀(島津),ESI串聯(lián)質譜儀：TripleTOF5600 (SCIEX, Framingham, MA,USA),離子源為 Nanospray III source(SCIEX,Framingham, MA, USA),放射器為石英材料拉制的噴針(New Objectives, Woburn, MA,USA).

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設置 經(jīng)3mg/L熒蒽分別誘導1,3,6,8d 4組實驗,每組設置2個平行樣,將1d設置為實驗對照組,3個比對組為3d/1d、6d/1d和8d/1d.

1.3.2 降解菌蛋白提取 采用貝博試劑盒提取降解菌的細胞全蛋白[7],之后通過 Bradford定量和SDS-PAGE進行蛋白質提取質控.

1.3.3 蛋白酶解和 iTRAQ 標記 每個樣品取100ug蛋白溶液;按蛋白：酶=40：1的比例加入Trypsin酶2.5ug,37℃酶解4h;按上述比例再補加Trypsin 1次,37℃繼續(xù)酶解 8h;酶解的肽段用Strata X柱除鹽,真空抽干.根據(jù)樣品數(shù)量,取出一定量 iTRAQ 標簽試劑;待試劑恢復至室溫后,每管試劑加入 50uL異丙醇,渦旋震蕩后低速離心;用0.5mol/L TEAB溶解肽段樣品,4個樣品,2次重復.第 1 批：113-1d-1,114-3d-1,115-6d-1,116-8d-1;第 2 批：117-1d-2,118-3d-2,119-6d-2,121-8d-2;混勻,室溫靜止2h.

1.3.4 肽段分離 采用 LC-20AB 液相系統(tǒng),分離柱為5μm×4.6mm×250mm Gemini C18柱對樣品進行液相分離.用 2mL流動相 A (5%ACN pH9.8)復溶抽干的肽段樣品并進樣,以 1mL/min的流速梯度洗脫：5%流動相 B(95% CAN,pH9.8)10min, 5%～35%流動相 B 40min,35%～95%流動相B 1min,流動相B持續(xù)3min,5%流動相B平衡10min.在 214nm 波長下監(jiān)測洗脫峰并每分鐘收集一個組分,結合色譜洗脫峰圖合并樣品得到20個組分,然后冷凍抽干.

1.3.5 高效液相 將抽干的肽段樣品用流動相A (2%ACN,0.1%FA)復溶,20000g離心10min后,取上清進樣.通過 LC-20AD納升液相色譜儀進行分離.樣品首先進入trap柱富集并除鹽,隨后與自裝C18柱(內徑75μm, 柱料粒徑3.6μm, 柱長15cm)串聯(lián),以300nL/min流速通過如下有效梯度進行分離：0～8min,5%流動相 B(98%ACN,0.1%FA);8～43min,流動相 B 從 8%線性升至 35%;43～48min,流動相 B 從 35%升至 60%;48～50min,流動相B從60%升至80%;50～55min,80%流動相B;55～65min,5%流動相 B.納升液相分離末端直接連接質譜儀.

1.3.6 質譜檢測 經(jīng)過液相分離的肽段進入到ESI串聯(lián)質譜儀,參數(shù)設置如下：離子源噴霧電壓2300V,氮氣壓力為30psi,噴霧氣為15,噴霧接口處溫度 150℃.采用高靈敏度模式進行掃描,一級質譜掃描累積時間為 250ms,掃描質量范圍為350～1500Da.基于一級掃描信息,按照一級譜圖中的離子強度從高到低,對選擇強度超過150cp的前30個進行碎裂并掃描二級信息,篩選標準如下：m/z為 350～1250Da;電荷數(shù)目為 2～5 個電荷;母離子動態(tài)排除設置為：在一半的出峰時間內(約12s),相同母離子的碎裂不超過 2次.二級質譜的掃描累積時間為100ms.針對iTRAQ 類型的數(shù)據(jù)采集,碎裂能量選擇根據(jù)iTRAQ試劑調整,第2個四級桿Q2在100Da時的離子傳輸效率為100%.

1.3.7 蛋白質分析 原始質譜數(shù)據(jù)通過 Proteo Wizard工具msConvert轉成MGF格式,之后轉好的MGF文件經(jīng)過鑒定軟件Mascot 2.3.02和實驗前期由轉錄組構建的該菌蛋白比對數(shù)據(jù)庫比對搜索得到最終的蛋白鑒定結果.最終選定的可信蛋白必須包含至少兩個可信的特異性(Unique)肽段.具體搜索參數(shù)如下,Type of search： MS/MS Ion search; Enzyme： Trypsin; Fragment Mass Tolerance： 0.1Da; Mass Values： Monoisotopic;Variable modifications： Oxidation (M),iTRAQ8plex (Y); Peptide Mass Tolerance： 0.05Da;Fixed modifications： Carbamidomethyl(C),iTRAQ8plex (N-term), iTRAQ8plex (K).

iTRAQ數(shù)據(jù)的定量采用測試公司自主研發(fā)的 IQuant軟件[8],該軟件整合了 Mascot Percolator[9]算法,該算法采用機器學習算法自動對數(shù)據(jù)庫搜索結果進行重新打分,從而提高結果的鑒定率.首先在譜圖/肽段水平進行1% FDR的過濾(PSM-level FDR≤0.01),從而獲得顯著性鑒定的譜圖和肽段列表.接著基于“簡約原則”,利用肽段進行蛋白組裝,并產生一系列的蛋白組.為了控制蛋白的假陽性率,流程還會在蛋白水平上以FDR 1%再次進行過濾(Protein-level FDR≤0.01),所使用策略為Picked protein FDR[10].IQuant的工作流程主要包括以下幾個步驟：蛋白質過濾,報告基團標簽純度校正, 定量值歸一化,缺失值補全,蛋白定量值計算,統(tǒng)計檢驗分析,最終結果展示.主要IQuant定量參數(shù)為Quant-peptide： Use All Unique peptide; Quant-number： At least two unique spectra; Normalization： VSN; Protein-Ratio：Weighted average; Statistical Analysis： Permutation Test.利用兩組iTRAQ定量的比值＞2或＜0.5認為有差異,取兩組平均值為最終差異倍數(shù).

2 結果

2.1 差異蛋白聚類分析

以熒蒽誘導1d的紅球菌BAP-1的蛋白為對照,設置3個比對組分別為3d/1d、6d/1d和8d/1d.以 Q-value≤0.05 和 Fold change＞2(即上調＞2,下調＜0.5)為差異蛋白的篩選條件,共鑒定到796個蛋白,其中表達上調的差異蛋白為613個,表達下調的為183個.由表1可知,與對照組相比,隨誘導時間的延長,鑒定到的差異蛋白總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,說明菌體適應熒蒽的外界脅迫環(huán)境有一個循序漸進的過程.而上調蛋白呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,下調蛋白呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.其中3d/1d鑒定到的差異蛋白總數(shù)和上調差異蛋白數(shù)目最多,說明在第 3天菌體受熒蒽的誘導刺激最為敏感.3個比對組中上調蛋白數(shù)目都始終遠高于下調蛋白,說明熒蒽作為一種外源壓力脅迫條件,相比于抑制或削弱某些蛋白發(fā)揮功能來說,菌體更需要刺激或促進上調的蛋白來增強適應外界條件的能力,以維持細胞原有的生命活動.

表1 3個比對組鑒定到的差異蛋白數(shù)Table 1 The number of differentially expressed proteins in three clusters

圖1 三個比對組鑒定到的差異蛋白維恩圖Fig.1 Venn diagram depicting differential expressed proteins in three clusters

從圖1看出,3個比對組中共同差異表達蛋白數(shù)目為111個,其中上調為56個,下調為55個.在熱圖中,紅色部分代表上調蛋白,顏色越亮,上調倍數(shù)越大,即為顯著上調差異蛋白,而綠色部分代表下調蛋白,顏色越亮,下調倍數(shù)越大,即為顯著下調差異蛋白.由此,從圖2看出,在1d/3d中顯著上調的蛋白有二磷酸核苷激酶,三磷酸腺苷合酶,DinB家族蛋白,磷酸丙酮酸水合酶和琥珀酰 CoA合成酶.在 6d/1d中有孢壁蛋白,甘油激酶以及一種假定蛋白表現(xiàn)為顯著上調.而在8d/1d,除了與 6d/1d相同的兩個蛋白(孢壁蛋白和假定蛋白),還有細胞色素氧化酶和另一種假定蛋白表現(xiàn)為明顯的上調.同理,從圖 3中得出,相應的顯著下調蛋白主要分布在1d/3d和6d/1d.在 1d/3d顯著下調的是細胞色素泛醌氧化酶,NADP轉氫酶,甲酸鹽乙酰轉移酶和 5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶;在6d/1d顯著下調的有乙酰轉移酶,甘油磷酸鹽脫氫酶,醌蛋白葡萄糖脫氫酶以及異亮氨酰 tRNA合成酶.而且大部分下調程度大的蛋白位于3d/1d,而下調不明顯的基本位于 8d/1d,這也驗證了前面論述的菌體在 3d對熒蒽的刺激反應最為敏感,而隨著適應能力的增強,下調蛋白的調控變化幅度逐漸減小.

2.2 差異蛋白COG功能分類

COG(蛋白相鄰類的聚簇)是對蛋白質進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫.將鑒定得到的蛋白質和COG數(shù)據(jù)庫進行比對分析,預測這些蛋白質可能的功能并統(tǒng)計其功能分類[11].

3個比對組3d/1d、6d/1d和8d/1d中上調和下調蛋白共參與20個COG功能分類中,這表明菌體在熒蒽誘導下的蛋白功能參與不同的生物過程,差異蛋白并不是起單一作用的,而是共同構成一個互作的關系網(wǎng)絡.如圖4所示,COG分析顯示3個比對組中,無論是上調還是下調,占比例都很大的是能量產生與轉化、氨基酸轉運與代謝、以及翻譯,核糖體結構與生物合成,這表明菌體可以替換或抑制已有的能量供應蛋白,轉而刺激或增強其他蛋白的功能,從而利用熒蒽作為其唯一碳源和能源進行代謝以維持自身的生命活動.其次 COG功能分類中占比例較大的是翻譯后修飾、蛋白周轉、伴侶.雖然其他功能分類中差異蛋白所占比例較小,但在控制細胞生長以及熒蒽的運輸和代謝過程中同樣起著不可忽視的作用.

圖2 3個比對組中56個共同上調差異蛋白的熱圖Fig.2 Heat maps depicting the 56 shared up-regulated proteins in all three clusters

圖3 3個比對組中55個共同下調差異蛋白的熱圖Fig.3 Heat maps depicting the 55 shared down-regulated proteins in all three clusters

2.3 差異蛋白的GO富集分析

Gene Ontology(GO)是一個國際標準化的基因本體功能分類體系工具,用來全面描述生物體中基因和蛋白的屬性.GO總共有3個大類,分別描述參與的生物過程(BP),基因或蛋白的分子功能(MF)以及構成的細胞組件(CC)[12].差異蛋白的GO富集分析是通過顯著差異蛋白和作為背景的全體鑒定蛋白相比,利用超幾何檢驗找出顯著富集的GO條目.

通過GO功能分類對3個比對組中的差異蛋白進行富集分析,將 3組中共同顯著富集且差異蛋白數(shù)目較多的 GO條目列于表 2.在生物過程大類中,更多的蛋白參與氧化還原反應,前體代謝物和能量的產生,有機化合物氧化的能量來源以及呼吸作用,另外還包括一些代謝,比如鳥嘌呤核苷,三羧酸,GTP,小分子分解和單一生物分解的代謝過程.這說明熒蒽確實已經(jīng)刺激到菌體的能量產生,改變了相關的呼吸方式,從而影響到細胞代謝的過程.這與 COG功能分類中能量產生與轉換以及氨基酸轉運與代謝所占比例最大結果相符.在分子功能大類中,主要富集的功能是活性能力,包括氧化還原活性,結構分子活性,巰基酸和碳硫鍵的連接活性.另外還有核糖體的結構,這與COG功能分類中翻譯,核糖體結構與生物合成功能一致.這些表明菌體在代謝熒蒽時主要依靠蛋白的催化活性與核糖體作用的.在細胞組件這一大類中,差異蛋白更多地參與到高分子配合物,細胞器以及脂肪酸β-氧化多酶復合物的構成組件中,由此可知菌體在受到熒蒽脅迫時,絕大部分蛋白用于構建細胞,并維持細胞正常的生理機能.

圖4 3個比對組中差異蛋白的COG功能分類Fig.4 COG analysis of differentially expressed proteins in every cluster

表2 3個比對組中差異蛋白數(shù)的GO富集分析Table 2 The enrichment of GO terms analysis of the number of differentially expressed proteins in three clusters

2.4 差異蛋白的pathway富集分析

KEGG (京都基因與基因組百科全書)是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的[13],用于查詢代謝通路、酶促通路、酶或編碼酶的基因以及生物化學物質的在線數(shù)據(jù)庫.其 Pathway途徑數(shù)據(jù)庫包含了相應生物通路中分子相互作用網(wǎng)絡以及具體某個生物所特有的變化形式[14],確定蛋白質參與的最主要信號轉導通路和生化代謝通路.在生物體內,不同蛋白相互協(xié)調,相互調控表現(xiàn)其生物學行為,基于 Pathway的分析更有助于了解基因或蛋白的生物學功能.差異蛋白的pathway富集分析與GO富集分析方法類似.

由圖 5可見,在 3個比對組中共同參與的pathway富集通路有7個,分別是不同環(huán)境中的微生物代謝,碳代謝,糖酵解/糖異生,檸檬酸循環(huán),丙酸鹽代謝,核糖體和磷酸肌醇代謝.顯然,這些途徑中參與不同環(huán)境中的微生物代謝通路的蛋白數(shù)量最多,表明熒蒽刺激菌體激活了新的途徑來適應新環(huán)境.而磷酸肌醇代謝在 3個比對組中的富集因子都較高,而且這一代謝通路還與下游的檸檬酸循環(huán)和糖酵解/糖異生代謝過程有關聯(lián),表明這一代謝與菌體降解熒蒽的關系更加密切.

圖5 3個比對組中差異蛋白的pathway富集Fig.5 Significant enrichment pathways analysis in three clusters

3 討論

3.1 與代謝有關的共同差異蛋白

111個共同差異蛋白中有60個(包括24個上調和36個下調)參與到 7個代謝過程(能量產生與轉化;氨基酸的轉運與代謝;核苷酸的轉運與代謝;糖的轉運與代謝;輔酶的轉運與代謝;脂質的轉運與代謝;無機離子的轉運與代謝).

細胞色素C是呼吸鏈的一員,在不同的氧化還原過程中發(fā)揮重要作用,是一種著名的電子轉移蛋白[15].細胞色素氧化酶是新陳代謝旺盛的標志物[16].本實驗中發(fā)現(xiàn)3個細胞色素氧化酶,其中包括細胞色素C氧化酶兩個亞基明顯上調,前者在3d/1d、6d/1d和8d/1d分別上調高達4.3,7.84和8.85倍,另一個是細胞色素泛醇氧化酶下調明顯,在 3個比對組中平均下調 0.28倍.類似的,Jeng[17]等發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元為了適應長期暴露在PAHs誘導下的低水平氧化應激環(huán)境,最初增加的就是細胞色素氧化酶的活性.

有 5個激酶有差異表達,上調的是甘油激酶和 2個二磷酸核苷激酶;下調的是脫氫葡萄糖激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶.有 2個三磷酸腺苷合成酶在3d/d上調明顯,分別上調10倍和4.49倍.ATP合酶是由線粒體 DNA(mtDNA)編碼,而mtDNA是細胞內氧化應激的主要目標,PAHs暴露情況下容易刺激該酶[18].結合蛋白有5個都上調表達,其中ATP結合蛋白有3個,其余是ABC轉運底物結合蛋白和胞外溶質結合蛋白.ATP結合蛋白是細菌從環(huán)境中獲取碳源以維持細菌生長基本活動最重要的途徑[15].寡肽轉運蛋白 Opp屬于ABC型超家族,可以利用ATP水解產生的能量實現(xiàn)底物的轉運[19]. OppC是組成底物進入細胞的通道跨膜蛋白,在三個比對組中平均上調4.31倍,說明熒蒽的跨膜運輸通道能力大大提升.脫氫酶參與大部分生物的氧化還原反應,其中以催化供體醇基團、醛基團、酮基團和烷基團最為常見.本實驗中有10個脫氫酶有表達差異：3個上調是二氫吡咯羧酸鹽脫氫酶在 3d/1d上調 8.22倍,?；o酶a脫氫酶在6d/1d上調5.36倍,醛脫氫酶在8d/1d上調5.45倍.7個下調中變化顯著的有甘油磷酸鹽脫氫酶平均下調 0.25倍和醌蛋白葡萄糖脫氫酶平均下調0.26倍.下調數(shù)目高于上調數(shù)目,這表明熒蒽作為一種低生物可利用的不飽和物質,脫去氫離子是非常困難的,菌體不得不降低大部分對熒蒽降解無用的蛋白,而有針對性地提高關鍵脫氫酶的表達.

另外值得注意的差異蛋白還有超氧化物歧化酶,它是一種抗氧化劑蛋白[20].在分枝桿菌JS14降解熒蒽時,作為一種排毒蛋白,該酶上調表達,以緩和氧化應激壓力的外界條件[21].琥珀酰輔酶合成酶在3d/1d上調高達8.83倍,它是一種線粒體酶,在 TCA循環(huán)中能催化從琥珀酰-CoA到琥珀酸和游離輔酶 a的可逆過程[22].5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶主要參與了蛋氨酸的生物合成,在三個比對組中下調非常明顯,分別為 0.19、0.31和 0.21倍,這說明熒蒽強烈抑制了蛋氨酸的生成.而在菲誘導冬小麥根系時,此酶是顯著上調的[23].

3.2 與信息儲存和傳遞有關的共同差異蛋白

111個共同差異蛋白中有14個(包括4個上調,10個下調)參與到 3個信息儲存與傳遞過程(翻譯,核糖體結構與生物合成;轉錄;復制,重組與修復).在不同的生存環(huán)境中,菌體必須改變自身轉錄,翻譯和修飾方面的相關蛋白以產生不同的基因表達.

核糖體蛋白有 3個且都顯著上調,分別是30S ribosomal protein S10(平均上調5.62倍), 50S ribosomal protein L18partial(平均上調 4.13倍)和30S ribosomal protein S2(平均上調3.04倍).在很多蛋白質組學研究中,核糖體蛋白的表達變化總是占很大部分.菌株SJTE-1改變了8種核糖體的蛋白表達水平,這有助于菌體適應受限制的雌激素條件,減少毒性作用,并保證細胞的正常新陳代謝[15].有 3個 tRNA酶都下調,其中2個合成酶,分別是異亮氨酰tRNA合成酶和甘氨?；鵷RNA合成酶,還有1個連接酶是蛋氨酸t(yī)RANA連接酶,這與上述 5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶抑制蛋氨酸的生物合成結果相符.

3.3 與細胞過程和信號有關的共同差異蛋白

111個共同差異蛋白中有14個(包括7個上調和7個下調)參與到6個細胞過程和信號過程(細胞周期調控,細胞分裂,染色體分割;細胞壁/細胞膜/細胞外膜生物合成;細胞運動;翻譯后修飾,蛋白周轉,伴侶;信號轉導機制;胞內運輸,分泌和小泡運輸).

趨化性蛋白顯著上調平均5.25倍,鞭毛蛋白發(fā)生上調平均3.28倍,這也許是菌體為了接觸并攝取更多的熒蒽營養(yǎng)物質而提高自身運動活性的結果.有3個轉移酶且都下調,分別是辛酮糖酸轉移酶,糖基轉移酶/轉肽酶和前蛋白移位酶.

3.4 其他共同差異蛋白

111個共同差異蛋白中有23個(包括20個上調和 3個下調)參與到其他過程(一般功能預測,未知功能等).

有 3個孢被蛋白都上調表達,這表明菌體在不良碳源環(huán)境可促進芽孢的形成.有 2個免疫抑制劑前體物發(fā)生上調,表明菌體抵御外界毒性,排除代謝物及有毒物質以保護菌體自身代謝活動.

4 結論

4.1 以熒蒽誘導 1d的菌體蛋白為對照,設置三個比對組分別為 3d/1d, 6d/1d和 8d/1d.以Q-value≤0.05 和 Fold change＞2(即上調＞2,下調＜0.5)為差異蛋白的篩選條件,共鑒定到796個差異蛋白,其中表達上調的 613個,下調的 183個.共同差異表達蛋白數(shù)目為111個,其中上調為56個,下調為55個.

4.2 通過 COG功能分析發(fā)現(xiàn)絕大部分差異蛋白參與到能量產生與轉化,氨基酸轉運與代謝,以及翻譯,核糖體結構與生物合成過程.

4.3 通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)大部分蛋白參與到生物過程中的氧化還原反應,能量產生和代謝過程,在分子功能中主要參與氧化還原活性,在細胞組件中更多蛋白參與到高分子配合物和細胞器部分.

4.4 通過 pathway富集分析發(fā)現(xiàn)參與不同環(huán)境中的微生物代謝通路的蛋白數(shù)量最多,磷酸肌醇代謝在三個比對組中的富集因子都較高.

4.5 111個共同差異蛋白中參與代謝有關的蛋白數(shù)目最多,關鍵的上調蛋白有細胞色素 C、三磷酸腺苷合成酶、二磷酸核苷激酶等激酶,還有一些結合蛋白和脫氫酶等;下調顯著的是5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶.參與信息儲存與傳遞有關的共同差異蛋白主要是核糖體蛋白.與細胞過程和信號有關的共同差異蛋白主要是趨化性蛋白和鞭毛蛋白.還有一些其他蛋白共同組成蛋白互作網(wǎng)絡從而降解熒蒽.

[1]Haritash A K, Kaushik C P. Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs)： A review [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009,169(1—3)：1-15.

[2]Ross P, Huang Y, Marchese J, et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents [J]. Molecular & Cellular Proteomics,2004,3(12)：1154-1169.

[3]Evans C, Noirel J, Ow S Y, et al. An insight into iTRAQ： where do we stand now? [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,404(4)：1011-1027.

[4]施旭駿,趙 超,牛 辰,等.應用iTRAQ定量蛋白質組學研究海分枝桿菌 mkl的基因功能 [J]. 微生物學報, 2016,56(9)：1496-1503.

[5]朱傳智,趙雁林,黃香玉,等.定量蛋白質組學分析鏈霉素耐藥和敏感結核分枝桿菌臨床分離株 [J]. 微生物學報, 2013,53(2)：154-163.

[6]林小瓊.基于iTRAQ技術的高效表達木聚糖酶重組畢赤酵母細胞的蛋白組學研究 [D]. 廣州：華南理工大學, 2013.

[7]廖麗萍.短短芽孢桿菌對芘降解特性及差異蛋白分析 [D]. 廣州：暨南大學, 2015.

[8]Wen B, Zhou R, Feng Q, et al. IQuant： An automated pipeline for quantitative proteomics based upon isobaric tags [J].PROTEOMICS, 2014,14(20)：2280-2285.

[9]Brosch M, Yu L, Hubbard T, et al. Accurate and Sensitive Peptide Identification with Mascot Percolator [J]. Journal of Proteome Research, 2009,8(6)：3176-3181.

[10]Savitski M M, Wilhelm M, Hahne H, et al. A Scalable Approach for Protein False Discovery Rate Estimation in Large Proteomic Data Sets [J]. Molecular & cellular proteomics, 2015,14(9)：2394-2404.

[11]Roman L Tatusov N D F J, Boris Kiryutin E V K D, Mekhedov S L, et al. The COG database： an updated version includes eukaryotes [J]. Bmc Bioinformatics, 2003,4：41-56.

[12]Ashburner M, Ball C, Blake J, et al. Gene Ontology：tool for the unification of biology [J]. Nature Genetics, 2000,25(1)：25-29.

[13]Kanehisa M. From genomics to chemical genomics： new developments in KEGG [J]. Nucleic Acids Research, 2006,34(90001)：D354-D357.

[14]黃瑩瑩,白 羽,王 艷,等.基于iTraq技術的加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻細胞差異表達蛋白 [J]. 中國環(huán)境科學,2015,35(6)：1822-1830.

[15]Xu J, Zhang L, Hou J, et al. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of the global response to 17β-estradiol in estrogendegradation strain Pseudomonas putida SJTE-1 [J]. Scientific Reports, 2017,7：41682.

[16]Crépeaux G, Grova N, Bouillaud-Kremarik P, et al. Short-term effects of a perinatal exposure to a 16polycyclic aromatic hydrocarbon mixture in rats： Assessment of early motor and sensorial development and cerebral cytochrome oxidase activity in pups [J]. NeuroToxicology, 2014,43：90-101.

[17]Jeng H A. Chemical composition of ambient particulate matter and redox activity [J]. Environmental Monitoring and Assessment,2010,169(1-4)：597-606.

[18]Woo S, Lee A, Denis V, et al. Transcript response of soft coral(Scleronephthya gracillimum) on exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons [J]. Environmental Science and Pollution Research,2014,21(2)：901-910.

[19]張偉欣,李春陽,陳秀蘭.細菌肽轉運蛋白的研究進展 [J]. 微生物學通報, 2014,41(9)：1856-1863.

[20]Han J, Gao P, Zhao S, et al. iTRAQ-based proteomic analysis of LI-F type peptides produced by Paenibacillus polymyxa JSa-9mode of action against Bacillus cereus [J]. Journal of Proteomics,2017,150：130-140.

[21]Lee S, Seo J, Keum Y, et al. Fluoranthene metabolism and associated proteins in Mycobacterium sp. JS14 [J]. Proteomics,2007,7(12)：2059-2069.

[22]Quan X, Sato-Miyata Y, Tsuda M, et al. Deficiency of succinyl-CoA synthetase α subunit delays development, impairs locomotor activity and reduces survival under starvation in Drosophila [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017,483(1)：566-571.

[23]Shen Y, Du J, Yue L, et al. Proteomic analysis of plasma membrane proteins in wheat roots exposed to phenanthrene [J].Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(11)：10863-10871.