劉超，景贊，黃志勇

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

納他霉素作為一種天然、廣譜、高效、安全的食品防腐劑被廣泛用于糕點、肉制品、果蔬汁、發(fā)酵酒等食品[1]，美國食品及藥物管理局于1982年正式批準納他霉素作為食品添加劑使用[2]，1996年我國專業(yè)人士對納他霉素進行評價并建議批準使用，現(xiàn)已列入食品添加劑使用標準。GB 2760-2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定納他霉素在醬油中不得使用。

現(xiàn)有的文獻報道及國家標準顯示納他霉素的檢測方法主要有分光光度法[3]、液相色譜法[4-8]等。分光光度法靈敏度低、特異性差，很難滿足殘留量的測定，液相色譜法是食品中納他霉素的國標方法，但由于食品的復(fù)雜性，該方法往往很難消除基質(zhì)干擾。同時，現(xiàn)有的方法多采用甲醇或乙酸水溶液提取直接分析，雜質(zhì)較多，容易假陽性且易污染儀器。本實驗優(yōu)化了納他霉素的提取方法并建立了靈敏度高、特異性強的液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法檢測醬油中納他霉素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇：色譜純，批號：67-56-1，Dikma提供；乙酸：色譜純，批號：20140421，天津市科密歐化學試劑有限公司提供；乙酸銨：優(yōu)級純，批號：50166，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供；亞鐵氰化鉀：分析純，批號：2015072501；乙酸鋅：分析純，批號：2014111201；無水硫酸鎂：分析純，批號：2014092001，成都市科隆化工試劑廠提供；PSA粒度，批號：S07-1102；C18粉末粒度：40～70 μm，批號：01-00100，WELTECH(WUHAN)CO.,LTD.提供。

1.2 標準物質(zhì)

鈉他霉素：批號：C16208400，純度：89.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH提供。

1.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱3.9 mm×150 mm；流動相：(A)：甲醇、(B)：10 mmol/L甲酸銨；流速：0.4 mL/min；進樣體積：10 μL，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫表

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200質(zhì)譜儀，質(zhì)譜參數(shù)：ESI負離子模式。離子源參數(shù)見表2，多反應(yīng)檢測(MRM)見表3。

表2 離子源參數(shù)

表3 多反應(yīng)檢測(MRM)

1.5 標準曲線的配制

1.5.1 標準儲備液的制備(1 mg/mL)

精密稱取10 mg納他霉素到10 mL容量瓶中，用0.2%乙酸-甲醇溶液定容至刻度，避光，-20 ℃儲存。

1.5.2 標準工作溶液的制備(5 μg/mL)

吸取125 μL的儲備液到25 mL容量瓶中，用0.2%乙酸-甲醇溶液定容至刻度。

1.5.3 基質(zhì)標準曲線的制作

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，精密加入0，50，100，200，400，500，1000 μL標準工作溶液，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 g)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。配成0，10，20，40，80，100，200 ng/mL的基質(zhì)標準曲線。

1.6 樣品制備

1.6.1 提取

精密稱取樣品2 g于25 mL容量瓶中，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。

1.6.2 凈化

稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。

1.7 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。凈化：稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析，作為空白溶液。用空白樣品溶液將標準工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根據(jù)色譜圖測得信噪比，按S/N=3∶1，計算檢出限和定量限。

1.8 方法的準確性

低濃度加標回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成10 ng/mL的質(zhì)控樣品。

中濃度加標回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成20 ng/mL的質(zhì)控樣品。

高濃度加標回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成40 ng/mL的質(zhì)控樣品。

1.9 精密度和重復(fù)性

稱取3份2 g空白樣品于3個25 mL容量瓶中，每瓶加入標準工作溶液75,150,300 μL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續(xù)進樣3針，計算相對標準偏差RSD。

取濃度為15,30,60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各3份經(jīng)前處理后進樣分析，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

圖1 納他霉素的標準曲線

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，精密加入0,50,100,200,400,500,1000 μL標準工作溶液，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。配成0,10,20,40,80,100,200 ng/mL的基質(zhì)標準曲線。以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并列出標準曲線的數(shù)學方程和線性范圍。

由圖1可知，納他霉素在濃度0～200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)R值=0.9999≥0.99，納他霉素在上述線性范圍內(nèi)良好。選取0～200 ng/mL為本實驗的線性范圍。

2.2 專屬性、檢出限和定量限

目標化合物出峰處無干擾，一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖應(yīng)清晰可見，見圖2～圖4。

圖2 納他霉素一級質(zhì)譜圖

圖3 納他霉素二級質(zhì)譜圖

圖4 納他霉素對照品色譜圖

采用空白樣品加標準溶液的方法測定，精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，按上述方法進行前處理，得空白樣品溶液，用空白樣品溶液將混合標準工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。納他霉素的方法的檢出限為5.14 μg/kg，定量限為15.7 μg/kg。

由圖2～圖4可知，納他霉素色譜圖周圍無雜質(zhì)峰干擾，一級、二級質(zhì)譜圖清晰可見，選擇664.1為納他霉素母離子，選擇碎片離子中豐度較高的3個碎片離子137.1，155.0，162.1作為定性和定量離子。此方法可有效避免誤判。

2.3 方法的準確性

采用空白樣品加標準回收法測定[9-13]，取濃度分別為10，20，40 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品3份經(jīng)前處理進樣分析，每種濃度平行進樣3針，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度，除以理論加入濃度，獲得方法回收率，即準確度結(jié)果。

表4 不同質(zhì)量濃度下的納他霉素回收率結(jié)果(n=3)

由表4可知，納他霉素在高、中、低3個水平回收率均在79.4%～93.1%之間。低濃度回收率略低，隨著濃度的增大，回收率接近100%，這是因為在低水平時，系統(tǒng)誤差較大，隨著濃度的增加，系統(tǒng)誤差逐漸變小。

2.4 方法的重復(fù)性

取濃度為15，30，60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各3份經(jīng)前處理后進樣分析，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。

表5 不同質(zhì)量濃度下的納他霉素重復(fù)性測定結(jié)果

由表5可知，重復(fù)性RSD<5%。表明方法重復(fù)性良好。

2.5 方法的精密度

取濃度為15，30，60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各1份連續(xù)測定3次。測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度。

表6 不同質(zhì)量濃度下納他霉素精密度測定結(jié)果

由表6可知，納他霉素精密度<3%，表明儀器精密度良好，在此范圍內(nèi)，可取得良好精密度。

3 結(jié)論

本實驗針對醬油中納他霉素建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，優(yōu)化了前處理方法。著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、方法的準確性、重復(fù)性、精密度等指標。結(jié)果顯示：該方法在0～200 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；納他霉素方法的檢出限為5.14 μg/kg；添加濃度在10，20，40 ng/mL 3個水平條件下的平均回收率在79.4%～93.1%之間；3個水平下重復(fù)性<5%，精密度<3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準確等特點，適用于醬油中納他霉素的測定。

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