李清清，姚 靜，韋祖樟

（廣西大學動物科學技術學院，南寧530005）

以PRRSV為載體表達外源基因的研究進展

李清清，姚 靜，韋祖樟

（廣西大學動物科學技術學院，南寧530005）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種以呼吸系統(tǒng)和繁殖障礙為特征的傳染病，已被公認為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要經濟性疾病。目前，傳統(tǒng)的活疫苗免疫是防控豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的主要手段，但該疫苗的安全性和有效性還需進一步提高。本文就對近年來以PRRSV感染性克隆作為工具表達外源基因的重組病毒的研究進展做一綜述。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；載體；感染性克隆；外源基因

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以呼吸系統(tǒng)和繁殖障礙為特征的疾病。臨床表現(xiàn)主要以妊娠母豬發(fā)生流產、木乃伊胎、死胎以及各階段豬發(fā)生呼吸道疾病為特征[1]。此病首先于1987年在美國發(fā)現(xiàn)，近30年來已在全世界范圍內廣泛流行。PRRSV基因的遺傳多樣性、感染機體的免疫抑制性和持續(xù)性使其難以控制[2]。PRRS已被公認為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要疾病。

PRRSV屬于動脈炎病毒科（Arteriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus）。PRRSV分為兩個基因型：歐洲1型和北美2型。PRRSV基因組為不分節(jié)段，單股正鏈RNA，全長約為15 kb，基因組5'端有帽子結構和非編碼區(qū)（UTR），3'端有UTR和poly(A)尾。從5'端到3'端，至少有10個開放閱讀框（open reading frame，ORF）[3]。依次分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORFs3～7，以及最新發(fā)現(xiàn)的ORF5a。占基因組全長3/4的ORF1a和ORF1b編碼病毒基因組復制和轉錄相關的酶復合物，這些酶復合物還在病毒拮抗干擾素過程中起著重要的作用。PRRSV基因組3'端至少有8個ORFs（ORF2～ORF7）來編碼病毒結構蛋白。其中，ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5分別編碼GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白。ORF2b、ORF5a、ORF6和ORF7分別編碼非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基質蛋白M和核衣殼蛋白（Nucleocapsid），也稱N蛋白。結構蛋白的表達需要病毒通過5' UTR末端以及結構蛋白編碼區(qū)域的轉錄調控序列（transcriptional regulation sequence，TRS）之間的相互作用，采用不連續(xù)性轉錄(discontinuous transcription）方式產生至少6種亞基因mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)。亞基因組RNA與mRNA1（亦即病毒基因組RNA，vRNA）共享5' UTR、3' UTR及poly(A)尾[4]。

目前，疫苗免疫是防控PRRSV的主要手段。商品化的PRRSV疫苗有滅活苗和弱毒苗。PRRS滅活疫苗保護率低。弱毒疫苗的保護效果比滅活苗好，但不能保護臨床感染和排毒，也存在毒力返強的潛在危險，所以研制更加安全、有效的基因工程疫苗是當前研究的熱點。基于反向遺傳操作基礎上構建的PRRSV活病毒載體疫苗是未來PRRSV疫苗的研發(fā)方向之一。本文對以PRRSV為載體，通過缺失病毒復制非必須的基因以及插入外源病毒保護性抗原，構建重組PRRSV疫苗或基因缺失疫苗的研究進展情況做一綜述，探討其作為高效新型PRRS疫苗的可行性。

1 NSP2非必需區(qū)域插入外源基因的研究進展

nsp2是PRRSV變異最大的非結構蛋白。nsp2編碼基因全長可達3500 nt。不同基因型毒株nsp2同源性僅為30%，相同基因型毒株nsp2同源性最高也只有60%[5]。nsp2高變區(qū)域常發(fā)生外源基因的插入、基因片段的缺失、堿基序列的變異。特別是nsp2高變區(qū)基因缺失最為常見，比如我國分離代表性毒株HuB、JXA1以及來自美國的MN184的nsp2基因編碼區(qū)均含有不同大小氨基酸的缺失。而在PRRSV細胞傳代的過程中，nsp2高變區(qū)氨基酸也易缺失。在MARC-145細胞中反復傳代后，PRRSV TJ株和JX143株的nsp高變區(qū)分別出現(xiàn)120 aa和88 aa的缺失。Eric A.Nelson[6]在PRRSV感染性克?。╒R2332）的基礎上，將PRRSV nsp2高變區(qū)部分氨基酸進行人為缺失，發(fā)現(xiàn)nsp2能夠耐受432 aa的缺失。在其它PRRSV毒株的感染性克隆的基礎上對nsp2高變區(qū)進行缺失，也發(fā)現(xiàn)nsp2能夠缺失[7]。這些研究結果說明nsp2是一個理想的外源基因插入位點。PRRSV nsp2屬于免疫顯性蛋白，有較強的免疫原性。PRRSV感染的豬體可在1～2周內產生較高的針對nsp2的抗體。對非必須區(qū)的免疫抗原表位進行缺失，有利于構建基因組缺失標識疫苗。Ying Fang[8]用北美1型PRRSV野毒株（SD01～08）構建的全長感染性克隆的基礎上，缺失nsp2中的一個免疫性表位ES4，在其nsp2區(qū)域插入綠色熒光蛋白基因，拯救的重組病毒的細胞中能看到GFP的表達。將重組病毒感染豬后，可用ELISA方法檢測將重組病毒和親本病毒進行區(qū)分。結果表明，表位ES4缺失并同時表達GFP的重組病毒可以作為一種潛在標記疫苗。然而，在MARC-145細胞中連續(xù)傳至8代后，重組病毒的GFP基因開始逐漸缺失。采取同樣的策略，在北美2型PRRSV的感染性克?。‵L12）的基礎上，在PRRSV的nsp2基因高變區(qū)插入GPF基因，拯救的重組病毒能夠在細胞中表達GFP蛋白[9]。在PRRSV 2型原型毒株VR-2332感染性克隆的基礎上，對nsp2高變區(qū)進行缺失，并在缺失的位點插入FGP基因。發(fā)現(xiàn)重組病毒能產生熒光，但是重組病毒的插入位點不穩(wěn)定，隨著病毒的傳代，熒光逐漸消失[10]。有趣的是，在疫苗株PRRSV感染性cDNA克?。℉uN4 -F112）基礎上，其nsp2區(qū)域缺少25氨基酸，在這缺失位點中插入一段編碼新城疫病毒核蛋白（NDV-NP）B細胞抗原表位的基因。拯救的病毒在細胞中連續(xù)培養(yǎng)至20代，通過間接免疫熒光和基因組測序的方法可鑒定出插入的NDV-NP能夠穩(wěn)定表達。將拯救的重組疫苗病毒接種豬只，可檢測其血清得到該重組病毒包含NDV-NP特異的抗體，且血清中不含有缺失的25氨基酸抗體，說明該重組疫苗株可作為潛在的標識疫苗[11]。

總之，NSP2中間高變區(qū)含有對病毒復制的非必需區(qū)域，是較為理想的外源基因插入位點。nsp2免疫原性很強，含有較多的抗原表位，可將病毒復制非必需的免疫原性的表位缺失，是構建基因缺失疫苗的理想位點。但一些研究表明，nsp2高變區(qū)的某些位點插入外源基因具有不穩(wěn)定性，一定程度上影響了其作為重組疫苗插入位點的理想靶標。nsp2的遺傳多變，重組病毒缺失的nsp2免疫原性表位也可能存在于nsp2自然缺失的野毒株中，這在一定程度上影響標識疫苗的研發(fā)。

2 ORF1和ORF2之間插入外源基因的研究進展

相鄰ORFs之間存在一定數(shù)量的重疊序列是PRRSV基因組的一個特點，特別是在ORF2、ORF3和ORF4之間，重疊序列可達到100 nt以上。PRRSV基因排列的復雜性，增加了對PRRSV進行遺傳操作難度。特別的是，編碼非結構蛋白的ORF1b和編碼GP2a蛋白的ORF2之間并無重疊序列，兩者之間相差1個核苷酸，這一特性使得該位置成為研究外源基因插入的關鍵性突破口。

在北美PRRS毒株P129感染性克隆的基礎上，在ORF1a和ORF2a中插入兩個獨特的限制性酶切位點和轉錄調控序列6（TRS6），將EGFP和圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）的衣殼蛋白（Cap）編碼基因分別插在TRS6之后，使得GFP和PCV2 Cap蛋白以獨立亞基因組單元進行轉錄和表達。拯救的重組病毒在細胞上能夠穩(wěn)定傳37代。將拯救的重組病毒接種豬只，用ELISA檢測接種豬只5周后的血清，能夠檢測到GFP基因和PCV2衣殼基因的特異的抗體[12]。這些研究表明表達的外源蛋白具有良好的免疫原性，該重組病毒可作為一種可能的多價疫苗。使用同一感染性克隆，Yongming Sang[13,14]等在PRRSV的ORF1b和ORF2之間插入一系列外源基因（海腎熒光素基因、蟲熒光素蛋白基因、紅色、綠色熒光蛋白基因、I型干擾素基因）。除了攜帶蟲熒光素基因的重組質粒未能拯救出重組病毒之外，其它重組質粒均能夠拯救出重組病毒。有意思的是，表達干擾素的重組病毒感染細胞后能釋放出有活性的干擾素，激活細胞的抗病毒通路，對共感染或者二次感染的PRRSV均有抑制的作用。重組病毒分泌的干擾素同樣對重組病毒產生抑制，盡管重組病毒能夠在細胞中穩(wěn)定存在，但病毒只能以較低的滴度復制，這降低了其作為重組疫苗的潛在價值。在經典株PRRSV感染性克?。ˋPRRSV）的基礎上，在ORF1b和ORF2a中插入PCV2的衣殼蛋白（Cap），使PCV2 Cap蛋白以獨立亞基因組單元進行轉錄和表達?？上У氖?，拯救的重組病毒攜帶的Cap基因在傳代的過程中逐漸缺失。進一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒在亞基因組轉錄的過程中，病毒能夠利用外源基因PCV Cap基因中的TRS或ORF2下游的潛在類TRS序列（cryptic TRS-like）產生新的亞基因組[15]。這是否是導致插入的外源序列不穩(wěn)定的因素還需進一步研究。在疫苗毒株感染性克?。℉uN4-112）的基礎上，在ORF1b和ORF2之間插入豬瘟疫苗毒C株的E2基因、集落刺激因子（GM-CSF）和海腎熒光素基因。拯救的重組病毒在細胞內穩(wěn)定，且重組的外源蛋白在體內有著相應的活性。表達 GM-CSF重組病毒體內能夠激活骨髓源單核樹突狀細胞和提高細胞因子的免疫應答[16,17]，這些研究為增強機體的免疫應答和提高疫苗的免疫效率以及為研制PRRS-CSF多價重組疫苗提供了堅實的基礎。在PRRSV的ORF2a/b引入一個額外的轉錄單元也可降低病毒的毒力。在HPPRRSV毒株中的ORF2a/b位置插入一個含有表達GFP基因的轉錄調控序列TRS6[18]，將重組病毒與親本病毒比較，重組病毒在細胞中增殖較慢，豬只感染重組病毒后，存活下來的臨床癥狀表現(xiàn)輕微甚至無臨床癥狀。

以上的研究表明，ORF1和ORF2之前插入單獨的轉錄調控元件，使得外源基因單獨作為一個亞基組進行轉錄和表達。該位點容納外源基因較大、重組病毒遺傳穩(wěn)定，且外源蛋白具有相應的生物學活性，是一個理想的外源基因插入位點。但是，也有個別研究報道發(fā)現(xiàn)，使用同樣的方法在該位點插入相同的外源基因，拯救不出重組病毒或某些重組病毒在傳代過程中出現(xiàn)外源基因缺失的現(xiàn)象，這可能與PRRSV毒株間的差異有關。

3 ORF7和3' UTR之間插入外源基因的研究進展

ORF7編碼病毒的核衣殼蛋白N緊鄰3' UTR。研究表明，在3' UTR中，緊隨ORF7終止密碼子之后的40 nt對于病毒的活性是非必需的。將基因1型PRRSV毒株3' UTR替換2型基因毒株中，嵌合cDNA克隆，仍然可以成功拯救出嵌合病毒[19]。說明盡管兩者的3' UTR一級核苷酸序列差異大，但是它們之間具有包含類似功能的高級結構，而且2型PRRSV N蛋白C端可以缺失4個氨基酸，其活性不會受到影響[20]。這些研究結果初步表明ORF7末端和3' UTR起始端可進行一定數(shù)量核苷酸的缺失。在PRRSV疫苗株感染性克隆（CH-1R）的基礎上，在N蛋白編碼區(qū)和3' UTR插入一個TRS6，并插入GFP基因或白細胞介素4（IL-4）。拯救的重組病毒在細胞傳代過程中保持穩(wěn)定。將重組病毒免疫豬，發(fā)現(xiàn)重組病毒免疫豬比親本毒株免疫豬血液中的雙陽（CD4+CD8+）T細胞和IL-4水平要高，但它卻不能顯著提高PRRSV疫苗的保護效力[21]。運用相同的方法，他們也曾在N蛋白編碼區(qū)和3' UTR插入一個集落刺激因子（GM-CSF）。重組病毒免疫豬血液中的雙陽（CD4+CD8+）T細胞和IL-4也同樣不能提高其保護效力[22]。從這些研究情況看，ORF7和3' UTR之間是較為理想的外源基因插入位點，但還需進一步研究此位點能夠容納的外源片段的大小以及外源蛋白的表達活性的情況。

4 展望

目前商品化的PRRSV疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗。滅活疫苗效果不明顯，弱毒活疫苗對異源毒株保護性差，免疫后出現(xiàn)毒力返強等問題也屢有報道。活疫苗無法與野毒株進行區(qū)分，使得該病難以凈化。為了克服滅活疫苗和弱毒活疫苗的缺陷，研究者們將把焦點放在研發(fā)安全有效的新型基因工程疫苗上。隨著反向遺傳操作技術不斷進步，通過研究PRRSV的一系列與毒力相關的位點以及合適的外源基因的插入位點，針對性地對病毒進行有效的改造，都有可能獲得理想的重組病毒，用來研制新型的基因工程疫苗。

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THE RESEARCH PROGRESS ON EXPRESSION OF FOREIGN GENE BASED ON THE PRRSV INFECTIOUS CLONE

LI Qing-qing, YAO Jing, WEI Zu-zhang

(College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome characterized by respiratory and reproductive disorders in piglets and sows has spread worldwide and become the most economically signi fi cant disease. Immunization with live attenuated vaccines is the primary method for the prevention and control of PRRSV. However, the safety and efficacy of the live vaccines need further improved. This review summarizes progress of expression of foreign genes using infectious cDNA clone of PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; vector; infectious clone; foreign gene

S852.659.6

A

1674-6422（2018）01-0089-05

2017-02-21

國家自然科學基金項目（31372444，31660716）；廣西自然科學基金項目（2016GXNSFAA380159）

李清清，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

韋祖樟，E-mail：zuzhangwei@163.com