李曉麗 董佳慧 吉鴻超 佟虎成 王 欣

（1.承德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北承德 067000；2.承德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，河北承德 067000）

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)重復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫延伸等簡(jiǎn)單的3個(gè)溫度循環(huán)，可在很短的時(shí)間內(nèi)將極微量的靶核酸擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，得到大量特定目的基因片段，獲得極高的檢測(cè)敏感性[1]。其主要缺點(diǎn)為極易污染，極微量的污染即可造成假陽(yáng)性的結(jié)果，且處理起來(lái)非常麻煩。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室污染的發(fā)生及處理情況，分析核酸實(shí)驗(yàn)室污染產(chǎn)生的途徑及控制措施。

1 材料

1.1 儀器

全自動(dòng)核酸提取儀（西安天隆TGuide S32），熒光PCR儀（Roche LightCycler 96）。

1.2 試劑

磁珠法核酸提取試劑（貨號(hào)Q5308），中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)：2017002）

2 方法

污染發(fā)生后，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行污染監(jiān)測(cè)，查找污染源，針對(duì)污染源進(jìn)行消毒處理，并通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證污染被清除。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)現(xiàn)污染

2017年5月，在一次常規(guī)監(jiān)測(cè)中，我實(shí)驗(yàn)室按照正常的操作規(guī)程檢測(cè)禽雙拭子樣品（檢測(cè)H7N9），同時(shí)設(shè)立了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（均為試劑盒配備），擴(kuò)增結(jié)束分析時(shí)發(fā)現(xiàn)所有的樣品及陰性對(duì)照均為陽(yáng)性，提示操作過(guò)程中某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)了污染。

3.2 追蹤污染源

出現(xiàn)污染后，首先考慮可能為試劑污染，使用新開(kāi)封的試劑盒重新檢測(cè)，結(jié)果仍顯示所有的樣品及陰性對(duì)照均為陽(yáng)性。將樣品送至省疫控中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在試驗(yàn)成立的前提下，所有樣品為陰性，說(shuō)明試劑及樣品均未被污染。由此推測(cè)，是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境或檢測(cè)儀器出現(xiàn)污染。

3.3 消毒處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收拾完畢，用84消毒液進(jìn)行臺(tái)面擦拭消毒，核酸自動(dòng)提取儀采用自帶紫外燈消毒15min，室內(nèi)采用歐爾琺過(guò)氧化氫消毒液機(jī)消毒1h。

3.4 消毒效果驗(yàn)證

消毒處理后，分兩階段進(jìn)行驗(yàn)證。首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和PCR擴(kuò)增儀的監(jiān)測(cè)，將5個(gè)裝有1ml超純水的離心管放置在實(shí)驗(yàn)室的不同區(qū)域，分別為核酸提取室的地面、操作臺(tái)上、通風(fēng)櫥內(nèi)和無(wú)菌室的地面和操作臺(tái)上，放置24h后，不經(jīng)提?。ㄔ噭┖嘘?yáng)性對(duì)照不需經(jīng)過(guò)提取直接進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)），直接加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液進(jìn)行擴(kuò)增，顯示PCR儀和環(huán)境均未被污染。然后進(jìn)行全自動(dòng)核酸提取儀的監(jiān)測(cè)，將上述環(huán)境樣品及陰性對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照不參與提?。┙?jīng)全自動(dòng)核酸提取儀提取后，加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液進(jìn)行擴(kuò)增，全部樣品及陰性對(duì)照呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，因此可初步判斷為全自動(dòng)核酸提取儀被污染，需要進(jìn)一步進(jìn)行消毒處理。

針對(duì)全自動(dòng)核酸提取儀的消毒：內(nèi)部首先用75%酒精擦拭消毒，然后連續(xù)采用自帶紫外線進(jìn)行消毒，消毒達(dá)到2h后，進(jìn)行驗(yàn)證。將上述5份樣品及陰性對(duì)照從核酸提取開(kāi)始，按照程序分步檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果顯示所有水樣本和陰性對(duì)照均檢測(cè)為陰性，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，表明核酸實(shí)驗(yàn)室可重新啟用。

3.5 形成滅菌程序

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理耗材及廢棄物，能滅菌的都需進(jìn)行一次滅菌。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面首先用84消毒液進(jìn)行擦拭消毒，室內(nèi)首先用紫外燈照射30min，然后用過(guò)氧化氫消毒液機(jī)進(jìn)行噴霧消毒1h，核酸自動(dòng)提取儀適當(dāng)延長(zhǎng)紫外線消毒時(shí)間。

4 討論

發(fā)現(xiàn)核酸實(shí)驗(yàn)室污染后應(yīng)立即停用，尋找污染源及污染部位，采取有效措施進(jìn)行消毒，清除污染源，反復(fù)驗(yàn)證，直到能夠重新啟用核酸實(shí)驗(yàn)室[2]。

核酸實(shí)驗(yàn)室污染的主要可能原因?yàn)椋簶颖疚廴?、試劑污染、環(huán)境污染、設(shè)備污染和其他污染。針對(duì)相應(yīng)的污染需制定相應(yīng)的解決措施。樣本和試劑污染排除較為簡(jiǎn)單，可更換樣本和試劑或送其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證，環(huán)境污染和設(shè)備污染則需要對(duì)設(shè)備和環(huán)境進(jìn)行徹底的消毒清潔。核酸實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)生污染，尋找污染源分析原因耗時(shí)耗力，所以防止污染尤其重要。

防止污染主要是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格按照相關(guān)要求進(jìn)行操作[3]。首先，核酸實(shí)驗(yàn)室需進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)，每個(gè)步驟都在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行，按照潔凈區(qū)-半污染區(qū)-污染區(qū)的單向工作流向，避免交叉污染；其次，各區(qū)的試劑、耗材、儀器等包括記號(hào)筆等應(yīng)專區(qū)專用，不得交叉使用；再次，嚴(yán)格控制進(jìn)入核酸實(shí)驗(yàn)室的人員和次數(shù)，非相關(guān)人員不得進(jìn)入，實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格安全操作行為；最后，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)室的清潔及消毒工作。

[1] 鐘旭琴，戴維.核酸實(shí)驗(yàn)室污染監(jiān)測(cè)及處理方法[J].醫(yī)藥前沿，2015，5（21）：343.

[2] 畢承恩，瞿文全，鄭麗娟，等.核酸實(shí)驗(yàn)室污染原因及處理[J].臨床血液學(xué)雜志，2017，30（2）：135-137.

[3] 郭利華.PCR實(shí)驗(yàn)室的污染及控制措施[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（16）：2354-2355.