顧 鵬，劉 聞，袁 進(jìn)，徐名襯，陳傍柱，徐 濤，顧為望*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗動物中心，廣州 510515；2.東莞松山湖明珠實(shí)驗動物科技有限公司，廣東 東莞 523808)

I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)是一種常染色體隱形遺傳病，臨床上主要變現(xiàn)為嚴(yán)重的肝、腎損傷，甚至肝癌[1]。HT1患者肝中基因表達(dá)的改變是導(dǎo)致該病發(fā)病的原因，通過基因表達(dá)分析可以更好地了解該疾病的具體發(fā)病機(jī)制。然而，受到倫理道德的限制，很多研究無法直接在人體中進(jìn)行，必須首先依靠動物模型進(jìn)行廣泛的實(shí)驗評估和論證。因此，建立可靠地實(shí)驗動物模型將更有助研究人員認(rèn)識該疾病本質(zhì)及其相關(guān)的治療方法。為此，本文對I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和探討，為更好的研究該疾病提供一些線索。

1 I型遺傳性酪氨酸血癥臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制

I型遺傳性酪氨酸血癥又稱肝腎性酪氨酸血癥，總體患病約為1/2000～1/100000[2-3]。根據(jù)I型遺傳性酪氨酸血癥患者發(fā)病年齡，臨床上將該疾病分為急性型(發(fā)病年齡 < 2個月)、亞急性型(發(fā)病年齡2～6個月)和慢性型(發(fā)病年齡 > 6個月)[4]。急性患兒多在出生后2個月內(nèi)急性發(fā)病，病情迅速惡化，常在出生后第3～9月死于肝功能衰竭[5-6]。亞急性型與急性型相似，但癥狀出現(xiàn)在出生后2～6個月之間。慢性型發(fā)病時間通常在出生6個月之后，臨床表現(xiàn)以漸進(jìn)性肝和腎損害為主，隨著病情的發(fā)展最終會導(dǎo)致肝硬化和Fanconi綜合征，甚至出現(xiàn)佝僂病[7]。I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)發(fā)病原因是由于患者體內(nèi)缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解酶所致。FAH酶是酪氨酸代謝分解途徑的最后一步所需的酶，可將延胡索酸乙酰乙酸(fumarylacetoacetate，F(xiàn)AA)水解為富馬酸酯(fumarate)和乙酰乙酸(acetoacetate)[8]。FAH酶缺乏會導(dǎo)致有毒代謝物的積累，包括延胡索酰乙酰乙酸(FAA)和馬來酸乙酰乙酸(maleylacetoacetate)。由于其上游代謝物酪氨酸(tyrosine)、4-羥基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)含量升高，使中間代謝產(chǎn)物馬來酰乙酰乙酸進(jìn)一步積累，從而刺激產(chǎn)生旁代謝通路，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate)、琥珀酰丙酮增高(succinylacetone, SA)[9]。這兩種旁代謝產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合，是造成肝、腎損害的主要原因。當(dāng)不接受治療時，大多數(shù)HT1患者在嬰兒早期就會死于急性嚴(yán)重肝腎功能衰竭[7]。

2 I型遺傳性酪氨酸血癥小鼠模型

FAH基因在哺乳動物中非常保守，人、豬、大鼠和小鼠的cDNA(80%同源性)及蛋白質(zhì)(94%同源性)均有著高度同源性[6]。Fah基因缺陷小鼠最先報導(dǎo)作為研究人類HT1疾病的動物模型并可以通過尼替西農(nóng)(NTBC)給藥進(jìn)行維持治療。停藥后，該小鼠會發(fā)生漸進(jìn)性肝衰竭和腎小管功能障礙。

1979年Gluecksohn、Russell等[10-11]報導(dǎo)了c14CoS小鼠，該小鼠由于輻射造成了7號染色體大片段的刪除。純合的c14CoS小鼠在出生后數(shù)小時內(nèi)死亡同時伴有嚴(yán)重的肝損傷。研究發(fā)現(xiàn)，該小鼠體內(nèi)許多肝特異性酶都有減少甚至消失，包括酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Tat)[12]、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6P)[10]、谷氨酰胺合成酶(Gs)[9]、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pepck)[13]、醛縮酶B和血清白蛋白[14-15]等。相反，導(dǎo)致肝損傷的mRNA水平(Chop-1、Nmo-1)則都有上升[16-17]。肝、腎組織學(xué)上的損傷在c14CoS小鼠也有發(fā)現(xiàn)。但是，由于該小鼠的突變類型是大片段的基因刪除，導(dǎo)致例如酪氨酸激酶在內(nèi)的很多基因也被刪除了，因此與人類HT1患者的基因型表現(xiàn)存在一定的差異性。

1993年Grompe等[18]通過同源重組技術(shù)將小鼠Fah基因5號外顯子刪除，成功制備了Fah基因敲除小鼠(FahΔexon5mouse)并顯示出與c14CoS小鼠完全相同的表型。此后Overturf (1996)、Paulk (2010)、Lisowski (2012)、Huang(2011)、Zhu(2014)等先后制備了Fah基因敲除的小鼠模型[19-23]。Fah基因敲除小鼠往往會在新生仔鼠出生后1周內(nèi)死于嚴(yán)重肝損傷，但是通過在水中添加NTBC可以有效改善肝的損傷。NTBC撤藥后若繼續(xù)給予正常蛋白質(zhì)含量的飲食將會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝、腎疾病，通常6周后即會死亡[24]。目前，F(xiàn)ah-/-小鼠已經(jīng)成為研究I型遺傳性酪氨酸血癥理想的動物模型。2001年Aponte等[25]人通過ENU誘導(dǎo)制備了Fah基因點(diǎn)突變小鼠。這種單一堿基改變擾亂了核苷酸的剪接并產(chǎn)生一個編碼無效蛋白質(zhì)的等位基因。因此，該小鼠生化表型與其他Fah-/-突變動物一樣[20]。

2007年，Azuma等[26]將Fah-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rg-/-小鼠雜交獲得FRG(Fah-/-/Rag2-/-/Il-2rg-/-)小鼠，這為之后將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷的Fah-/-小鼠上實(shí)現(xiàn)肝臟的人源化奠定了基礎(chǔ)。但該方法須要進(jìn)行多次雜交和回交，費(fèi)時費(fèi)力。近年來興起的鋅指蛋白酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)可以直接在受精卵中進(jìn)行基因編輯而受到廣泛關(guān)注。Winer 等[27]利用鋅指蛋白酶將NODRag1-/-/Il2rg-/-(NRG)小鼠受精卵的Fah基因5號外顯子敲除，獲得的小鼠與Fah-/-小鼠和NRG小鼠雜交得到的FRG小鼠相比，人源肝細(xì)胞再植率幾乎相同；Li等[28]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了NRG小鼠中Fah基因的敲除，而耗時僅需6周，相比于傳統(tǒng)方法操作更為簡單，耗時更短。盡管如此，F(xiàn)ah基因敲除小鼠模型無法反映HT1患者關(guān)鍵的慢性病變，即肝纖維化和肝硬化[29]。

3 I型遺傳性酪氨酸血癥大鼠模型

作為實(shí)驗動物模型，在各種生理和病理方面，大鼠比小鼠更接近人類。大鼠體重比小鼠大至少10倍，能夠提供的血液、膽汁酸、細(xì)胞和組織也更多，對于后續(xù)實(shí)驗分析更為有利[30]。

2016年Zhang等[30]通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了Fah基因敲除大鼠。Fah-/-大鼠在NTBC停止給藥后出現(xiàn)體重下降，進(jìn)而死于漸進(jìn)性肝衰竭等其他并發(fā)癥，表現(xiàn)出與人類HT1患者常見癥狀相似的特征。相比于Fah-/-基因敲除小鼠，F(xiàn)ah-/-大鼠在NTBC停藥后血清ALT，AST和TBIL水平更高，組織學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)大量肝細(xì)胞死亡，這表明Fah-/-大鼠具有更嚴(yán)重的肝損傷現(xiàn)象[25,31]。此外，在NTBC停止給藥后，F(xiàn)ah-/-大鼠也檢測到腎小管損傷。與Fah基因突變小鼠不同，通過肝的宏觀變化，組織學(xué)分析和生化檢查發(fā)現(xiàn)Fah基因敲除的大鼠具有明顯的肝纖維化和肝硬化表型。

同年，Kuijk等[32]報導(dǎo)Fah-/-/Il2rg-/-大鼠模型可以用于評估體內(nèi)大鼠肝干細(xì)胞的功能。同時也證明了大鼠肝干細(xì)胞系特別適用于研究人類代謝紊亂大鼠模型，例如Gunn大鼠(CN綜合征型I型)，F(xiàn)ah-/-模型(酪氨酸血癥型I型)，血色素沉著癥模型以及Long Evans Cinnamon大鼠(威爾森氏病的模型)[33-35]。受益于大鼠肝干細(xì)胞系，這些模型將作為潛在的工具進(jìn)一步闡明這些疾病的分子機(jī)制以及檢查肝干細(xì)胞在移植后恢復(fù)肝功能的能力。

4 I型遺傳性酪氨酸血癥兔模型

目前，酪氨酸血癥I型小鼠和大鼠模型均已受到廣泛的重視和應(yīng)用。但是受限于嚙齒類動物大小、體型、生理及遺傳發(fā)育等與人類的差異性，因此一定程度上不能完全反應(yīng)人類HT1疾病的本質(zhì)。實(shí)驗兔作為中等動物模型，生理結(jié)構(gòu)、遺傳代謝以及發(fā)育上更加接近人類，且具有更長的壽命[36-37]。Fah-/-兔模型的建立可以為HT1肝損傷疾病的機(jī)理研究和治療提供更為可靠的模型。

2017年，Li等[38]通過TALENs基因打靶技術(shù)獲得了Fah雙等位基因敲除兔。Fah-/-基因敲除兔表現(xiàn)出HT1患者肝和腎損傷表型，但也有頻繁的眼部病變表型(主要是角膜炎)。這就使得其成為研究如何預(yù)防和治療HT1患者潛在并發(fā)眼部疾病良好的模型[39-40]。此外，從DNA水平、蛋白表達(dá)水平，血液生理生化水平以及病理變化等方面檢測結(jié)果顯示，與小鼠相比，F(xiàn)ah-/-兔更好的模擬了人類HT1疾病的表型。通過同種異體肝細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)，移植3個月后外源性肝細(xì)胞在Fah-/-兔模型肝臟中整合率達(dá)到80%，有效緩解了Fah-/-基因敲除兔的肝損傷，治療效果明顯[38]。

5 I型遺傳性酪氨酸血癥小型豬模型

小型豬體型大小、生理學(xué)、疾病發(fā)展等方面與人相似性更大，是生物醫(yī)學(xué)研究中理想的實(shí)驗動物模型，在探究人類疾病的預(yù)防措施、致病機(jī)制、治療效果、藥物篩選以及探索人類生命活動規(guī)律等方面均更有優(yōu)勢[41]。小型豬的解剖學(xué)特征比小型動物模型更接近人類，利用小型豬制備動物模型不僅更能模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展，而且手術(shù)操作更為宏觀簡單[42]。此外，小型豬器官的大小也使他們成為生產(chǎn)人類細(xì)胞、組織甚至異種器官移植最理想的選擇[43-44]。

2011年，Hickey等[29]通過腺相關(guān)病毒(AAV)和同源重組技術(shù)靶向破壞豬7號染色體Fah基因成功制備了Fah基因敲除雜合子豬(Fah+/-)。通過AAV載體打靶豬胎兒成纖維細(xì)胞5號外顯子，平均敲除效率達(dá)到5.4%。這些Fah基因敲除雜合子豬表型正常，具有良好的繁殖能力，突變的等位基因能夠穩(wěn)定遺傳，同時肝臟病理學(xué)沒有任何異常。雖然是雜合敲除，但是Fah雜合子豬的FAH蛋白水平和水解延胡索酰乙酰乙酸(FAA)的能力顯著降低。2014年，Hickey等[45]將Fah基因敲除雜合子豬進(jìn)行互交，成功培育了Fah-/-雙等位基因敲除純合子豬。研究發(fā)現(xiàn)，與HT1患者相似，如停止NTBC給藥時Fah-/-基因敲除純合子豬無法發(fā)育。其次，由于Fah酶缺乏，F(xiàn)ah-/-基因敲除純合子豬血液和尿液中酪氨酸和琥珀酰丙酮含量顯著上升。Fah酶缺陷導(dǎo)致延胡索酰乙酰乙酸(FAA)在細(xì)胞中積聚引起嚴(yán)重的肝損傷[46-47]。生化檢測發(fā)現(xiàn)血液中AST，堿性磷酸酶，氨和總膽紅素顯著上升，提示該豬有嚴(yán)重的肝損傷。除此以外，在NTBC撤藥后也檢測到腎小管損傷。2017年，該課題組通過降低NTBC維持給藥劑量后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ah-/-豬表現(xiàn)出生長遲緩和生化異常，如轉(zhuǎn)氨酶升高，琥珀酰丙酮(SA)和甲胎蛋白(AFP)升高，并呈現(xiàn)出NTBC劑量依賴特征。隨后，F(xiàn)AH-/-豬出現(xiàn)了肝纖維化、肝硬化和門靜脈高壓等慢性肝病表型[48]。該模型證實(shí)了Fah-/-豬作為一種新型肝硬化大動物模型，可以應(yīng)用于包括藥物開發(fā)和毒性測試以及評估現(xiàn)代成像等技術(shù)的研究。

6 總結(jié)與展望

最初，I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型作為研究人類HT1疾病的病理生理以及治療效果的理想動物模型而開發(fā)。而目前，它們已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肝生物學(xué)、肝干細(xì)胞以及肝癌基因治療的研究，同時也可用于制備人源化肝以及作為人肝細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器。除此以外，I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型也可用于評估肝外源細(xì)胞移植，如骨髓或成人胰島細(xì)胞移植的療效。這將使它們成為研究I型遺傳性酪氨酸血癥致病機(jī)制以及評估最新發(fā)現(xiàn)的肝祖細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞臨床前療效理想的模型。