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(1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002; 2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

植物抗菌活性蛋白,是植物抵御外界病原菌的一種物質(zhì),可抑制真菌的生長甚至殺死真菌[1]。植物在自然環(huán)境下生長發(fā)育的過程中,隨時會遭受各種病原菌的侵染,隨著植物體的進(jìn)化發(fā)展,植物體本身逐漸形成了一套天然的防御系統(tǒng),能夠在植物體內(nèi)合成一些物質(zhì)來抵抗外源病菌,抗真菌活性蛋白就是植物抵御外界病原菌的一種物質(zhì)[2-3]。抗菌蛋白通過抑制真菌生理代謝活動、降解真菌細(xì)胞壁、破壞真菌細(xì)胞膜、破壞細(xì)胞的核糖體及降解細(xì)胞中的核酸來保護(hù)植物體免受病原菌的浸染[4-5]。目前,對于抗菌生物活性蛋白的分離、活性表征、作用機(jī)理都有一定程度的探究[6-7],但相關(guān)理論及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的研究還有待進(jìn)一步深入,隨著植物生物活性蛋白研究的深入,其應(yīng)用范圍將會更廣泛。

小紅豆,是豆科類的一年生直立草本植物,種皮呈深紅色,故又被稱為紅小豆、赤豆、紅赤豆等。我國是小紅豆的原產(chǎn)地和出口大國,而且小紅豆?fàn)I養(yǎng)豐富,口感細(xì)膩,廣受人們的喜愛,被譽為糧食中的“紅珍珠”[8]。據(jù)報道,每100 g小紅豆中約含蛋白質(zhì)21.7 g,蛋白質(zhì)含量達(dá)22.65%,比大米的蛋白質(zhì)含量高2～3倍[9-10]。此外,小紅豆還具有較高的藥用價值,對糖尿病、高血壓、肝硬化、冠心病等現(xiàn)代高頻性疾病具有較好的輔助療效[11-12]。已有相關(guān)報道從紅豆中分離純化出具有抗惡性細(xì)胞增殖活性的多肽及HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[15]。而從豆科植物中開發(fā)新的抗真菌活性蛋白應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)以及基因工程等方面具有重大意義。目前,已有從黑豆[13]、花生[14]中分離得到植物抗真菌蛋白的報道,而小紅豆中的抗真菌蛋白未見報道。本文旨在從小紅豆中分離純化一種抗真菌蛋白,并對其生物活性進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小紅豆 福州永輝超市;尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) 福建省農(nóng)科院;Affi-gel Blue gel親和色譜填料 日本TOSOH公司;Sephadex SP C-25陽離子交換色譜填料 英國Amersham Biosciences公司;Sephadex G-50凝膠過濾色譜填料 美國GE Healthcare;其余化學(xué)試劑均為分析純。

XZ-21K型高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;FD-1C-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;UV/V-16/18型紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;MINI PROTEIN Ⅱ電泳儀 美國BIO RAD公司;超凈工作臺 美國Thermo Forma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗真菌蛋白的分離與純化

1.2.1.1 粗提液的制備 取25 g小紅豆種子,加入適量的蒸餾水浸泡24 h,使豆子吸水完全膨脹后取出去皮,加入250 mL NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行勻漿,經(jīng)紗布過濾,除去殘渣,收集濾液。濾液在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,收集上清液即為小紅豆蛋白的粗提液。

1.2.1.2 硫酸銨分級沉降 向蛋白質(zhì)粗提液中加入固體硫酸銨,按標(biāo)準(zhǔn)的硫酸銨飽和度配制表計算添加至其飽和度達(dá)到20%,磁力攪拌充分溶解后,于4 ℃靜置4 h,然后在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,收集上清液。繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨至其飽和度達(dá)80%,溶解后于4 ℃靜置4 h,在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,取沉淀物,用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液溶解沉淀,并用同樣的緩沖液充分透析,截留規(guī)格3500 Da,在4 ℃溫度下透析48 h,其間每8 h換一次透析液,即得到初分離樣品。

1.2.1.3 親和色譜純化 將透析后的樣品在4 ℃溫度下12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,去除沉淀,獲得的上清液上樣到已用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液平衡的Affi-gel Blue gel親和色譜柱中,并用同樣的緩沖液洗去未吸附的蛋白(在280 nm下測定洗出液吸光值,小于0.05為洗滌終點),再用含0～1 mol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,10 min/管,檢測280 nm下的吸光值。

1.2.1.4 離子交換色譜純化 將洗脫峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行透析,截留規(guī)格3500 Da,在4 ℃溫度下透析48 h,其間每8 h換一次透析液,離心后取上清液上樣到已用同樣緩沖液平衡好的Sephadex SP C-25陽離子交換色譜柱,洗去未吸附蛋白后(在280 nm下測定洗出液吸光值,小于0.05為洗滌終點),用含0～1 mol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,10 min/管,檢測280 nm下的吸光值。

1.2.1.5 凝膠過濾色譜純化 將洗脫峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行透析,濃縮后在-50 ℃下凍干成粉末,用去離子水進(jìn)行溶解,過0.22 μm的膜后用于凝膠過濾色譜。Sephadex G-50凝膠過濾色譜用去離子水平衡,上樣結(jié)束后去離子水進(jìn)行洗脫,直至洗出液在280 nm的吸光值小于0.05即認(rèn)定所有蛋白都被洗出。

1.2.2 SDS-PAGE 采用Laemmli方法[15],不連續(xù)電泳體系(12.5%分離膠,4%濃縮膠),起始電壓100 V,到達(dá)分離膠后電壓升至120 V,考馬斯亮藍(lán)染色。由相對遷移率計算目標(biāo)蛋白的相對分子質(zhì)量。

1.2.3 蛋白含量的測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用Lowry方法測定樣品蛋白含量[16]。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.0065X+0.0143,R2=0.9972。

1.2.4 抗菌蛋白抑菌活性的測定 采用瓊脂片擴(kuò)散法[17],真菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基,菌種采用來自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢鐮刀菌。將受試菌分別接種于培養(yǎng)基平板中央,放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落直徑長至4 cm左右時,在距菌落邊緣0.5 cm處貼上無菌濾紙片(直徑6.25 mm),并分別滴加8 μL濃度為40、20 μg/μL的抗菌蛋白溶液,將平板置于30 ℃中恒溫培養(yǎng),觀察其抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中所有數(shù)據(jù)均取三次重復(fù)實驗的平均值,采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 小紅豆抗真菌蛋白的分離純化

經(jīng)過緩沖液抽提、硫酸銨沉降后獲得的粗體液經(jīng)Affi-gel Blue gel親和色譜進(jìn)行純化,在280 nm下測量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖1所示。通過抑菌實驗,測得洗脫峰A2具有抗真菌活性,收集并合并A2峰組分。

圖1 小紅豆抗真菌蛋白的Affi-gel Blue gel親和色譜圖Fig.1 Affinity chromatography of the antifungal protein from small red beans on Affi-gel Blue gel

圖2 小紅豆抗真菌蛋白的Sephadex SP C-25離子交換色譜圖Fig.2 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex SP C-25

親和色譜洗脫峰A2組分的成分經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后仍比較復(fù)雜,經(jīng)透析后上樣到離子交換色譜Sephadex SP C-25柱中。在280 nm下測量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖2所示。在平衡液條件下沒有掛柱,直接被沖洗下來的峰稱為穿透峰,被洗脫液洗脫下來的峰稱為洗脫峰。由圖2可知,親和色譜洗脫峰A2經(jīng)陽離子交換色譜后,得到一個穿透峰S1和兩個洗脫峰S2、S3,通過抑菌實驗,測得洗脫峰S3具有抗真菌活性,收集并合并S3峰組分。

離子交換色譜洗脫峰S3組分經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后,出現(xiàn)兩條分子量相差較大的電泳條帶,S3組分經(jīng)透析、凍干濃縮后,用去離子水溶解,并上樣到凝膠過濾色譜Sephadex G-50柱中。在280 nm下測量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖3所示。

圖3 小紅豆抗菌蛋白的Sephadex G-50凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex G-50

由圖3可知,S3組分經(jīng)凝膠過濾色譜后只得到1個主要的色譜峰G1,顯然經(jīng)過層層分離純化后,樣液中含有的蛋白種類越來越少,更趨向于目標(biāo)蛋白。G1組分經(jīng)活性檢測被證明具有抑制真菌生長的生物活性,收集目標(biāo)組分并重復(fù)制備,以備后續(xù)研究。

2.2 SDS-PAGE

將分離純化各個步驟得到的組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定其純度以及分子量大小，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨著分離純化的逐步進(jìn)行,各組分的電泳條帶數(shù)越來越少,清晰度越來越高。親和色譜是純化的第一道工序,得到的蛋白質(zhì)溶液是多種成分的混合體系,經(jīng)離子交換色譜后,與蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對照,可看到,S3組分中至少存在2種蛋白,一種蛋白質(zhì)的分子量約為97.2 kDa,另一種的分子量低于6.5 kDa。而凝膠過濾色譜后的G1組分只有1個清晰的條帶,說明經(jīng)分離純化得到的抗菌蛋白已經(jīng)達(dá)到電泳純,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對數(shù)對它的相對遷移率(Rf)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),由此計算出G1組分分子量約為4 kDa。

圖4 小紅豆抗菌蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of the antifungal protein from small red beans注:1：小紅豆蛋白粗提液;2：硫酸銨沉降分離液; 3：親和藍(lán)膠色譜A2組分;4：離子交換色譜S3組分; 5：凝膠過濾色譜G1組分;M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量曲線Fig.5 Standard curves for protein molecular weight

2.3 蛋白含量的測定結(jié)果

以25 g小紅豆原材料為例,計算抗菌蛋白純化過程中的每一步所得樣品的蛋白含量,結(jié)果列于表1。由表1可知,25 g的小紅豆種子經(jīng)去皮后用緩沖液提取,約可得到粗蛋白溶液,隨著分離純化的逐步進(jìn)行,蛋白質(zhì)含量逐漸降低,一方面可能由操作造成損失,如緩沖液粗提時回收不完全、硫酸銨沉降離心后溶解不徹底等,另一方面蛋白質(zhì)逐漸純化,非目標(biāo)產(chǎn)物被逐步移除,這是蛋白質(zhì)含量減少的主要原因[21]。經(jīng)凝膠過濾色譜后得到的目標(biāo)蛋白含量為4.27 mg。

表1 小紅豆抗真菌蛋白純化過程中蛋白含量Table 1 Concentration of purification of antifungal protein from small red beans

2.4 抗真菌活性

小紅豆抗真菌蛋白對來自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)均具有一定的抑制作用。采用瓊脂片擴(kuò)散法,若樣品對真菌具有抑制作用,則表現(xiàn)為濾紙片周圍的局部菌絲體生長受到抑制,出現(xiàn)半圓形月牙狀的抑菌圈。小紅豆蛋白的抗真菌活性實驗結(jié)果見圖6。

圖6 小紅豆抗真菌蛋白抑菌活性Fig.6 Inhibitory activity of the antifungal protein from small red beans注：A:空白對照8 μL無菌水;B:40 μg/μL抗菌蛋白無菌水溶液;C:20 μg/μL抗菌蛋白無菌水溶液。

由圖6可以看出,在濾紙片B和C周圍都出現(xiàn)了較為明顯的抑菌圈,而A周圍真菌的菌絲正常生長,沒有出現(xiàn)半圓形抑菌圈。由此可見,小紅豆純化的抗菌蛋白對以上三種不同來源的真菌都表現(xiàn)出較強的抑制活性,且隨著抗菌蛋白濃度的提高,月牙形抑菌圈也越來越明顯。

3 結(jié)論

本研究通過緩沖液初提、硫酸銨分級沉降、親和色譜、離子交換色譜及凝膠過濾色譜等步驟從小紅豆中分離純化出一種抗菌蛋白。對各分離純化步驟得到的蛋白質(zhì)同時進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定,對比觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)凝膠過濾色譜后得到抗菌蛋白達(dá)到電泳純,且相對分子質(zhì)量約為4 kDa。通過純化的小紅豆抗菌蛋白對茄子尖孢鐮刀菌、甜瓜尖孢鐮刀菌及苦瓜尖孢鐮刀菌的抗性實驗證明小紅豆抗菌蛋白具有較強的抗真菌活性。

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