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(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長春 130117)

五味子為木蘭科五味子屬植物五味子Schisandrachinensis(Turcz)Baill的果實,習(xí)稱北五味子,五味子性酸、甘、溫,歸肺、心、腎經(jīng),有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效[1],五味子化學(xué)成分主要有木脂素、揮發(fā)油、多糖、有機酸、氨基酸等。藥理活性表明五味子具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性[2-8]。以往對五味子的研究主要集中在木脂素、多糖、有機酸等方面,而對五味子糖蛋白的研究未見報道。

研究表明,糖蛋白是一大類具有較強生物活性的物質(zhì)[9],近年來糖蛋白的研究越來越受到重視,而除游離蛋白是糖蛋白純化的重要環(huán)節(jié)。目前,常用的除蛋白方法主要有Sevage法、三氯乙酸法、蛋白酶水解法等[10]。其中,Sevage法是除蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法,其操作簡單,條件溫和,試劑廉價,是常用的除游離蛋白的方法[11]。本實驗采用單因素方法研究了不同因素對Sevage法除五味子糖蛋白中游離蛋白效果的影響,并在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計法與響應(yīng)面法對比確定得到Sevage法除五味子糖蛋白中游離蛋白的最佳工藝條件,最后進行了體外抗氧化活性研究,以期為五味子糖蛋白的進一步研究和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ),并為其今后開發(fā)藥品及保健品打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

北五味子藥材 采于吉林省長白山自然保護區(qū),經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為木蘭科五味子屬植物五味子Schisandrachinensis(Turcz)Baills的干燥果實;Bradford蛋白濃度測定試劑盒 天根生化科技有限公司;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、濃鹽酸等 均為國產(chǎn)分析純。

SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-1700紫外可見分光光度計 日本島津公司;JA1203N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AB265-S分析天平(十萬分之一)METTLER TOLEDO;沙冰料理機 中山市快特電器有限公司;S82-2磁力攪拌器 上海志威電器有限公司;UB-7pH計Denver Instrument;FDU-1200冷凍干燥機 東京理化器械株式會社。

1.2實驗方法

1.2.1 五味子糖蛋白的提取 稱取一定量北五味子干燥果實,0.1 mol/L NaOH勻漿,并將原液pH調(diào)9.5,35 ℃水浴提取3 h后離心(3500 r/min,15 min,下同),棄沉淀,收集上清液,并將pH調(diào)至3.4,靜置2 h后離心,棄上清,將沉淀用少量蒸餾水溶解,pH調(diào)至中性后裝入透析袋,透析過夜,將透析袋中液體冷凍干燥,此冷凍干燥物即為五味子糖蛋白[12]。

1.2.2 蛋白質(zhì)清除率測定 采用考馬斯亮藍Bradfrod法測定糖蛋白中蛋白質(zhì)的含量[13],得回歸方程A=0.15x+0.043,r=0.9989。按以下公式計算蛋白質(zhì)清除率:

蛋白質(zhì)清除率(%)=(脫蛋白前糖蛋白溶液中蛋白的含量-脫蛋白后糖蛋白溶液中蛋白的含量)/脫蛋白前糖蛋白溶液中蛋白的含量×100

1.2.3 多糖損失率測定 采用苯酚-濃硫酸法測定糖蛋白中多糖的含量[14],得回歸方程A=0.144x-0.045,r=0.9989。按以下公式計算多糖損失率:

多糖損失率(%)=(脫蛋白前糖蛋白溶液中多糖的含量-脫蛋白后糖蛋白溶液中多糖的含量)/脫蛋白前糖蛋白溶液中多糖的含量×100

1.2.4 綜合評分計算方法 綜合評分=[(脫蛋白率/最大脫蛋白率)×0.5+(最小多糖損失率/多糖損失率)×0. 5]×100

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 氯仿與正丁醇比例的確定 固定反應(yīng)條件為樣液與Sevage試劑比例為3∶1,振搖時間20 min,脫蛋白1次,考察氯仿與正丁醇比例(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對糖蛋白純化的影響[15]。

1.2.5.2 樣液與Sevage試劑比例的確定 固定反應(yīng)條件為氯仿與正丁醇比例為3∶1,振搖時間20 min,脫蛋白1次,考察樣液與Sevage試劑比例(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對糖蛋白純化的影響。

1.2.5.3 振搖時間的確定 固定反應(yīng)條件為氯仿與正丁醇比例為3∶1,樣液與Sevage試劑比例為3∶1,脫蛋白1次,考察振搖時間(5、10、15、20、25 min)對糖蛋白純化的影響。

1.2.5.4 脫蛋白次數(shù)的確定 固定反應(yīng)條件為氯仿與正丁醇比例為3∶1,樣液與Sevage試劑比例為3∶1,振搖時間20 min,考察脫蛋白次數(shù)(1、2、3、4、5次)對糖蛋白純化的影響。

1.2.6 正交實驗設(shè)計 以L9(34)表安排正交實驗,由單因素實驗結(jié)果設(shè)計因素水平表,見表1。

1.2.7 響應(yīng)面法優(yōu)選設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用Design-Expert 8.0.5.0軟件依據(jù)Box-Behnken[16]實驗設(shè)計原理,選擇氯仿與正丁醇比例(A)、樣液與Sevage試劑比例(B)、振搖時間(C)、脫蛋白次數(shù)(D)四個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,因素水平編碼見表2。

表2 響應(yīng)面實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.8 體外抗氧化實驗 根據(jù)響應(yīng)面實驗結(jié)果,取一定量最佳工藝條件下純化得到的五味子糖蛋白,進行抗氧化活性實驗。

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 取不同濃度的五味子糖蛋白溶液1 mL于10 mL試管,加入3 mL 0.004% DPPH溶液,渦旋混勻;空白組依次加入1 mL蒸餾水和3 mL 0.004% DPPH溶液,渦旋混勻;樣品對照組加入1 mL不同濃度的五味子糖蛋白溶液,再加入3 mL甲醇,渦旋混勻。置黑暗中靜置20 min,以甲醇為空白調(diào)零,以VC為陽性對照組,用紫外吸光光度計于517 nm下測其吸光度。清除率按下式計算,并計算IC50值[17]。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式中,A0為空白的吸光度,A1為加入樣品的吸光度,A2為樣品本身吸光度。

1.2.8.2 超氧陰離子清除率的測定 樣品組每管加入3 mL 0.1 mol/mL Tris-HCl(pH為8.2)緩沖溶液和不同濃度樣品溶液0.1 mL,放入25 ℃水浴20 min,加入0.3 mL已經(jīng)于25 ℃預(yù)熱的7 mmol/L鄰苯三酚溶液,于25 ℃精準(zhǔn)反應(yīng)4 min,最后加入1 mL10 mol/L鹽酸終止反應(yīng);空白組以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液;樣品對照組以0.3 mL蒸餾水代替0.3 mL 7 mmol/L鄰苯三酚溶液,用1 mL蒸餾水代替1 mL 10 mol/L鹽酸。以VC為陽性對照,用蒸餾水做空白調(diào)零,于420 nm波長處測其吸光度。清除率按下式計算,并計算IC50值[18]。

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式中,A0為空白的吸光度,A1為加入樣品的吸光度,A2為樣品本身吸光度。

1.2.8.3 還原能力的測定 取不同濃度的樣品溶液1 mL于試管,分別加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴保溫20 min,冷卻,加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻,離心(3000 r/min),取上清2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵,充分混勻,以蒸餾水做空白調(diào)零,在最大吸收波長700 nm下測其吸光度A1,考慮到糖蛋白本身的吸光度,以2.5 mL蒸餾水代替2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,其余步驟一樣,測得吸光度A2。VC為陽性對照,吸光度越大其還原能力越強。還原能力按下式計算[19]:

A=A1-A2

式中,A1為加入樣品的吸光度,A2為樣品本身的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)處理

2017年9月11日，肇慶中院作出“（2017）粵12刑初32號”刑事判決：被告人鄧強犯受賄罪，判處有期徒刑4年6個月，并處罰金人民幣50萬元；鄧強退出的贓款人民幣260萬元，依法予以沒收，并由扣押機關(guān)上繳國庫。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 氯仿與正丁醇比例的單因素實驗 由圖1可知,當(dāng)氯仿與正丁醇體積比為3∶1時,游離蛋白的清除率最大,同時多糖損失率達到最低值,這是由于在Sevage法脫蛋白過程中,氯仿對蛋白質(zhì)變性起重要作用,正丁醇只是起到一定的促進作用,因此選擇2∶1、3∶1、4∶1三個水平。

圖1 氯仿與正丁醇的比例 Fig.1 The ratio of chloroform and n-butanol

2.1.2 樣液與Sevage試劑比例的單因素實驗 由圖2可知,隨著樣液與Sevage試劑比例的增大,游離蛋白的清除率先逐步升高后趨于平緩,在比例從2∶1增大到3∶1時,蛋白清除率略有升高,同時多糖損失率最小,因此選擇2∶1、3∶1、4∶1三個水平。

圖2 樣液與Sevage試劑的比例Fig.2 The proportion of sample solution and Sevage reagent

圖3 振搖時間Fig.3 The shaking time

2.1.3 振搖時間的單因素實驗 由圖3可知,當(dāng)振搖時間為15 min時,蛋白清除率達到最大值,之后隨著振搖時間的增加,蛋白清除率基本不再升高,同時,多糖損失率在振搖15 min之前無明顯變化,之后逐漸增大,這是由于振搖15 min后,樣液中的大部分游離蛋白已經(jīng)除去,蛋白含量不會發(fā)生太大變化,因此選擇10、15、20 min三個水平。

圖4 脫蛋白次數(shù)Fig.4 The number of proteins on the removal

2.1.4 脫蛋白次數(shù)的單因素實驗 由圖4可知,脫蛋白次數(shù)在1～3次時,蛋白清除率有所升高,同時,多糖損失率略有升高,當(dāng)脫蛋白次數(shù)超過3次時,蛋白清除率基本保持不變,而多糖損失率升高則較為明顯,說明樣液中的游離蛋白已基本除去,所以選擇2、3、4次三個水平。

表3 正交實驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment design

表4 正交結(jié)果方差分析表Table 4 Variance analysis table of orthogonal results

注:** p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

2.2正交實驗

直觀分析結(jié)果表明(見表3),RC>RA>RB>RD,因此,影響Sevage法除五味子糖蛋白中游離蛋白效果的主次因素依次為C(振搖溫度)>A(氯仿與正丁醇比例)>B(樣液與Sevage試劑比例)>D(脫蛋白次數(shù)),方差分析表明(見表4),因素C(振搖溫度)具有極顯著影響,因素A(氯仿與正丁醇比例)與因素B(樣液與Sevage試劑比例)對提取過程有顯著影響,因素D(脫蛋白次數(shù))對實驗影響較小,綜上所述,最后確定最佳工藝條件為A2B2C2D2,即氯仿與正丁醇比例為3∶1,樣液與Sevage試劑比例為3∶1,振搖時間為15 min,脫蛋白次數(shù)為3次。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1 回歸方程擬合及方差分析 將所得實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.5.0軟件進行多元回歸擬合,得到綜合評分對氯仿與正丁醇的比例(A)、樣液與Sevage試劑的比例(B)、振搖時間(C)、脫蛋白次數(shù)(D)的二元多項回歸方程:

Y=73.00+0.74A+1.07B-0.92C+0.24D+0.016AB+0.65AC-2.38AD-0.31BC-2.20BD+0.89CD-3.79A2-2.95B2-4.02C2-3.89D2

表5 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Design scheme and result of response surface

表6 響應(yīng)面方差分析Table 6 Analysis variance of response surface

注:** p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

由表6可知,B、AD、BD、A2、B2、C2、D2對綜合評分影響極顯著,A、C對綜合評分影響顯著,D、AB、AC、BC、CD對綜合評分影響不顯著,根據(jù)F值可知,各因素對綜合評分影響的大小順序為:樣液與Sevage試劑的比例(B)>振搖時間(C)>氯仿與正丁醇的比例(A)>脫蛋白次數(shù)(D)。

2.3.2 交互作用分析 將兩個因素固定在0水平,經(jīng)Design-Expert 8.0.5.0軟件分析,觀察剩余兩個因素的交互作用。由表6可知,有兩組因素交互作用顯著,其等高線圖和響應(yīng)面圖見圖5、圖6。

圖5 氯仿與正丁醇的比例和脫蛋白次數(shù)對綜合評分影響Fig.5 Effect of the ratio of chloroform and n-butanol and the number of removing protein on the comprehensive score

圖6 樣液與Sevage試劑的比例與脫蛋白次數(shù)對綜合評分影響 Fig.6 Effect of the ratio of sample solution and Sevage reagent on the comprehensive score

由圖5可知,氯仿與正丁醇的比例(A)和脫蛋白次數(shù)(D)的等高線呈橢圓形[20],響應(yīng)面陡峭,隨著氯仿與正丁醇的比例(A)和脫蛋白次數(shù)(D)的增加,綜合評分逐漸增高并達到極值,之后緩慢下降,表明二者交互作用顯著,由圖6可知,樣液與Sevage試劑的比例(B)與脫蛋白次數(shù)(D)的等高線呈橢圓形,響應(yīng)面曲線較陡，隨著樣液與Sevage試劑的比例(B)與脫蛋白次數(shù)(D)的增加,綜合評分越來越高,達到極值后逐漸下降,表明兩者之間交互作用較為顯著。

通過Design-Expert 8.0.5.0軟件分析可知,Sevage法除五味子糖蛋白中游離蛋白的最佳工藝條件為:氯仿與正丁醇的比例3.15∶1、樣液與Sevage試劑的比例3.21∶1、振搖時間14.28 min、脫蛋白次數(shù)3.07次,結(jié)合實際操作,確定最佳工藝條件為:氯仿與正丁醇比例為3∶1、樣液與Sevage試劑的比例為3∶1、振搖時間14 min、脫蛋白次數(shù)3次。按照響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝條件,平行做3組驗證實驗,3次實驗中蛋白質(zhì)平均清除率為30.09%(RSD=1.41%),多糖平均損失率為4.71%(RSD=1.13%),綜合評分平均值為88.11。

2.4體外抗氧化實驗結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除率測定結(jié)果 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,其甲醇溶液為深紫色,最大吸收波長為517 nm,抗氧化物質(zhì)的加入與DPPH不成對電子配對,使其褪色,吸收減少,故可通過吸光度的減少程度測得抗氧化劑消除DPPH自由基的能力,以消除率表示。由圖7可知,在0.20～1.60 mg/mL范圍內(nèi),五味子糖蛋白對DPPH自由基有較強消除作用,且隨濃度的增大而增大,IC50值為1.08 mg/mL,但與VC相比,其清除能力較弱。

圖7 五味子糖蛋白對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Schisandra glycoprotein on DPPH free radical

2.4.2 超氧陰離子清除率測定結(jié)果 鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境下發(fā)生自動氧化反應(yīng),釋放出超氧陰離子,并進一步促進自氧化產(chǎn)物的積累,自氧產(chǎn)物濃度在一定時間內(nèi)呈線性增長,可以在較短時間內(nèi)維持穩(wěn)定,自氧化產(chǎn)物在420 nm處有最大吸收,故可通過計算吸光度的變化率測得抗氧化劑清除超氧陰離子的能力。由圖8可知,在0.20～1.60 mg/mL范圍內(nèi),五味子糖蛋白對超氧陰離子自由基有較強的消除作用,且隨濃度的增大而增大,IC50值為0.80 mg/mL,但與VC相比,其清除能力較弱。

圖8 五味子糖蛋白對超氧陰離子的清除作用Fig.8 Scavenging effects of Schisandra glycoprotein on Superoxide anion

2.4.3 還原能力測定結(jié)果 抗氧化劑使鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)被還原成亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6),Fe3+與亞鐵氰化鉀可以發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生的普魯士藍在700 nm處有強吸光峰,還原力與抗氧化劑的能力成一定正比例,所以吸光度值越大,說明產(chǎn)生的普魯士藍越多,抗氧化劑的還原能力越強,間接說明其抗氧化能力越強。由圖9可知,在0.20～3.20 mg/mL范圍內(nèi),五味子糖蛋白清除能力逐漸增強,但與VC相比,其還原能力明顯較弱。

圖9 五味子糖蛋白的還原能力Fig.9 Reduction of Schisandra glycoprotein

3 結(jié)論

首次采用Sevage法對五味子糖蛋白中游離蛋白的清除條件進行了研究,通過實驗綜合考察了氯仿

與正丁醇的比例,樣液與Sevage試劑的比例,振搖時間和脫蛋白次數(shù)對五味子糖蛋白中游離蛋白清除效果的影響,采用正交實驗和響應(yīng)面法對除蛋白工藝進行了優(yōu)選,最后確定的最佳工藝條件為氯仿與正丁醇的比例為3∶1,樣液與Sevage試劑的比例為3∶1,振搖時間為14 min,脫蛋白次數(shù)為3次,此條件下,蛋白質(zhì)平均清除率為30.09%,多糖平均損失率為4.71%,綜合評分平均值為88.11。過實驗我們發(fā)現(xiàn),響應(yīng)面法優(yōu)化工藝精確度高,能很好的預(yù)測實驗結(jié)果?？寡趸钚匝芯勘砻?五味子糖蛋白具有較強的清除DPPH自由基和超氧陰離子的能力(IC50值為1.08 mg/mL和0.8 mg/mL),并具有一定的還原能力。本文對于Sevage法純化五味子糖蛋白的研究具有重要的意義,這為進一步開發(fā)利用五味子糖蛋白提供了理論基礎(chǔ)。

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