, ,*,,, ,

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000;2.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州 646000;3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

桑椹(Mulberry)富含糖分、有機(jī)酸、游離氨基酸、維生素及微量元素,是一種極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的水果[1-2]。桑椹果酒是以新鮮桑椹和桑椹汁為原料,利用酵母菌將糖經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精等產(chǎn)物,再經(jīng)陳釀成為酒質(zhì)醇厚芳香、酒體清亮透明的果酒產(chǎn)品[3]。目前,在桑椹果酒生產(chǎn)過(guò)程中,普遍出現(xiàn)揮發(fā)酸含量偏高的現(xiàn)象,影響果酒的品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),果酒中的揮發(fā)酸是各種低沸點(diǎn)酸及其衍生物的總和,其主要組分為醋酸[4]。桑椹果酒中揮發(fā)酸的形成主要分為以下幾個(gè)方面原因:一是高糖誘導(dǎo)的滲透壓脅迫酵母生成乙酸等副產(chǎn)物,導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸含量升高[5];其次是在桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中,由于溫度和pH選擇不當(dāng),影響了酵母菌體內(nèi)酶的活性,使反應(yīng)向生成揮發(fā)酸的方向進(jìn)行,從而生成大量揮發(fā)酸;最后是發(fā)酵菌株也會(huì)影響揮發(fā)酸的生成。揮發(fā)酸作為評(píng)價(jià)果酒質(zhì)量的重要指標(biāo),首先其含量過(guò)高,影響桑椹果酒口感和品質(zhì);其次是揮發(fā)酸被認(rèn)為是一種損害性物質(zhì),桑椹果酒中揮發(fā)酸過(guò)量,將給人帶來(lái)尖酸感和不愉快的醋味,故其含量應(yīng)該被控制在較低水平[6];再次是在桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中,揮發(fā)酸含量過(guò)高,影響酵母的發(fā)酵性能,造成發(fā)酵異常[7]。針對(duì)果酒揮發(fā)酸易超標(biāo)的問(wèn)題,楊華峰[8]等對(duì)冰紅酒進(jìn)行相關(guān)研究,結(jié)果表明葡萄汁初始糖度和SO2添加量明顯影響冰紅酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)酸的產(chǎn)生和積累。裴廣仁[9]等對(duì)冰葡萄酒的研究表明,初始糖度、發(fā)酵溫度與揮發(fā)酸生成量呈顯著正相關(guān),酵母種類也會(huì)影響揮發(fā)酸的生成量。為控制桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)酸含量,解決桑椹果酒揮發(fā)酸超標(biāo)的問(wèn)題,本文以揮發(fā)酸為主要指標(biāo),通過(guò)單因素、正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化桑椹果酒發(fā)酵工藝,研究發(fā)酵條件對(duì)桑椹果酒中揮發(fā)酸的影響,旨在為桑椹果酒的釀造提供數(shù)據(jù)支撐,也為揮發(fā)酸的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

桑椹 購(gòu)至四川某農(nóng)場(chǎng);菌種:活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;PDA液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制。

GZ-250-HS11恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LB20T手持糖度計(jì) 成都格納絲商貿(mào)有限公司;27000005-1酒精計(jì) 沈丘北郊玻璃儀器廠;XSP-42光學(xué)顯微鏡 廣州新怡光學(xué)顯微鏡廠家;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6890N-5975B) 美國(guó)安捷倫公司;手動(dòng)SPME進(jìn)樣器50/30UM DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 桑椹果實(shí)→選果→洗果→破碎打漿(加入0.02～0.03%(W/W)果膠酶)→成分調(diào)整(添加白砂糖)→主發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→初濾→調(diào)整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌[10]

1.2.2 操作要點(diǎn) 將桑椹置于室溫解凍,破碎打漿得桑椹汁,向桑椹果醪中添加一定量的白砂糖以調(diào)整果醪糖度;按比例接入酵母種子液于桑椹果醪中,將發(fā)酵醪置于一定溫度下發(fā)酵7 d,發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行攪拌以便完全發(fā)酵;發(fā)酵結(jié)束時(shí)進(jìn)行倒罐,并根據(jù)果醪糖度和酒精度,補(bǔ)加白砂糖,使最終酒度在10%vol左右,封罐進(jìn)入后發(fā)酵,發(fā)酵8～10 d至殘?zhí)呛啃∮? g/L;經(jīng)后發(fā)酵的桑椹果酒密封陳釀3～6個(gè)月;陳釀結(jié)束后,將桑椹果酒經(jīng)板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾、裝瓶并進(jìn)行巴氏滅菌。

1.2.3 種子液的制備及接種發(fā)酵 稱取0.3 g安琪活性干酵母于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)。在此過(guò)程中,對(duì)酵母進(jìn)行平板計(jì)數(shù),當(dāng)菌體濃度達(dá)到1×108數(shù)量級(jí)時(shí),接種發(fā)酵。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 分別選取糖度、溫度、pH和酵母接種量等單因素,進(jìn)行桑椹果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.1 糖度 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調(diào)節(jié)果醪pH4.0,酵母接種量6%,發(fā)酵溫度24 ℃,果醪糖度分別為140、160、180、200、220 g/L,發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí),分別測(cè)定發(fā)酵液的揮發(fā)酸含量、酒精度。

1.2.4.2 溫度 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調(diào)節(jié)果醪糖度180 g/L,pH4.0,酵母接種量6%,發(fā)酵溫度分別為22、24、26、28、30 ℃,發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí),分別測(cè)定發(fā)酵液的揮發(fā)酸、酒精度。

1.2.4.3 pH 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調(diào)節(jié)果醪糖度180 g/L,發(fā)酵溫度24 ℃,酵母接種量6%,pH分別調(diào)至3.50、3.75、4.00、4.25、4.50,發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí),分別測(cè)定發(fā)酵液的揮發(fā)酸、酒精度。

1.2.4.4 接種量 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調(diào)節(jié)果醪糖度180 g/L,pH4.0,發(fā)酵溫度24 ℃,酵母接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%,發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí),分別測(cè)定發(fā)酵液的揮發(fā)酸、酒精度。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn),以揮發(fā)酸和酒精度為考察指標(biāo),研究發(fā)酵條件對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響,正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 桑椹果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取 取10 mL最佳發(fā)酵工藝條件下桑椹果酒樣品于15 mL頂空瓶,加入1 g NaCl,置于恒溫磁力攪拌加熱平臺(tái)上。桑椹酒樣預(yù)熱10 min,將萃取頭伸入頂空部分,于45 ℃下吸附40 min后拔出,插入氣相色譜進(jìn)樣口,于230 ℃熱解析3 min。

1.2.7 桑椹果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析

1.2.7.1 色譜條件 DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 um);載氣:高純度氦氣,流速1 mL/min;無(wú)分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度為230 ℃;升溫程序:起始柱溫35 ℃,保持3 min,以6 ℃/min的速率升溫到150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min的速率升溫到230 ℃,保持3 min;

1.2.7.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;掃描質(zhì)量:20～550 u;離子源溫度230 ℃;接口溫度230 ℃。

1.2.7.3 桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性定量分析 利用GC-MS分析所得全離子圖譜,結(jié)合保留時(shí)間,運(yùn)用NIST 05標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行初步檢索,對(duì)桑椹果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析,并采用峰面積歸一化法確定各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)含量[11]。

1.2.8 分析方法 酒精度:酒精計(jì)法;總酸:電位滴定法;揮發(fā)酸:蒸餾法;pH:pH計(jì)直接測(cè)定;殘?zhí)?費(fèi)林試劑法[12]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別計(jì)算酒精度和揮發(fā)酸隸屬度。

酒精度隸屬度=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin),式中X為待計(jì)算隸屬度的酒精度值,Xmax為正交實(shí)驗(yàn)中最大酒精度值,Xmin為正交實(shí)驗(yàn)中最小酒精度值。

揮發(fā)酸隸屬度=(Ymax-Y)/(Ymax-Ymin),式中Y為待計(jì)算隸屬度的揮發(fā)酸值,Ymax為正交實(shí)驗(yàn)中最大揮發(fā)酸值,Ymin為正交實(shí)驗(yàn)中最小揮發(fā)酸值。

桑椹果酒中揮發(fā)酸權(quán)重[13]取0.6,酒精度的權(quán)重取0.4,分別對(duì)不同發(fā)酵條件下的桑椹果酒進(jìn)行綜合評(píng)分,即綜合評(píng)分=酒精度隸屬度×0.4+揮發(fā)酸隸屬度×0.6,并采用IBM SPSS Statistics 19對(duì)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1糖度對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

糖度不僅影響成品果酒的酒精含量,對(duì)果酒中揮發(fā)酸的產(chǎn)生也發(fā)揮著重要作用。由圖1可知,隨著糖度的增加,酒精度呈逐漸上升趨勢(shì),揮發(fā)酸先降低后升高,當(dāng)糖度在160 g/L時(shí),揮發(fā)酸最低。在低糖條件下,酵母能進(jìn)行正常的酒精代謝,桑椹果酒中揮發(fā)酸的含量相對(duì)較低,當(dāng)糖度超過(guò)160 g/L時(shí),高糖形成的高滲透壓脅迫酵母發(fā)生不完全發(fā)酵形成揮發(fā)酸等副產(chǎn)物,導(dǎo)致桑椹果酒中揮發(fā)酸逐漸上升。結(jié)合揮發(fā)酸和酒精度的含量變化情況,當(dāng)糖度在160 g/L左右條件下,在保證桑椹果酒正常發(fā)酵效果的情況下,揮發(fā)酸含量最低。

圖1 糖度對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.1 The effects of sugar content on volatile acidity of mulberry wine

2.2溫度對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

由于微生物的生長(zhǎng)、繁殖和代謝需要適宜的溫度環(huán)境。因此在桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中,溫度的控制極為重要,溫度選擇不適會(huì)造成發(fā)酵過(guò)程中酵母菌受溫度脅迫而出現(xiàn)發(fā)酵緩慢、遲滯及產(chǎn)生不良代謝副產(chǎn)物,引起揮發(fā)酸含量增大[14-15]。

由圖2可知,隨著發(fā)酵溫度的上升,揮發(fā)酸先下降后上升,酒精度先升高后降低,且當(dāng)發(fā)酵溫度控制在24 ℃時(shí),揮發(fā)酸含量最低,酒精度達(dá)到最高。其原因可能是酒精發(fā)酵途徑中乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的最適酶活溫度在24 ℃左右,當(dāng)溫度升高,菌體內(nèi)酶活性發(fā)生變化,導(dǎo)致酒精發(fā)酵不能正常進(jìn)行,使反應(yīng)向生成揮發(fā)酸的途徑進(jìn)行,從而使桑椹果酒酒精含量降低,揮發(fā)酸含量升高。因此當(dāng)發(fā)酵溫度控制在24 ℃左右時(shí),在保證桑椹果酒正常發(fā)酵效果的情況下,揮發(fā)酸含量最低。

圖2 溫度對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.2 The effects of temperature on volatile acidity of mulberry wine

2.3pH對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

微生物的繁殖、代謝普遍受pH的影響,在桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中,酵母菌體內(nèi)酶系組成與發(fā)酵液pH密切相關(guān),隨著pH的變化,酵母菌體內(nèi)酶系組成和活性隨之發(fā)生改變,其代謝產(chǎn)物也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[16]。

由圖3可知,隨著pH的升高,揮發(fā)酸先下降后上升,酒精度先升高后降低。由于在通常情況下,桑椹果酒的pH維持在3.70～3.80的范圍內(nèi),過(guò)高或過(guò)低的pH會(huì)影響酵母菌體內(nèi)酶系組成及其活性,導(dǎo)致酵母菌酒精代謝途徑被抑制,而揮發(fā)酸代謝途徑的酶促反應(yīng)得到加強(qiáng),從而使桑椹果酒酒精度降低,揮發(fā)酸升高。結(jié)合揮發(fā)酸和酒精度的含量,當(dāng)發(fā)酵初始pH在4.00左右時(shí),在保證桑椹果酒正常發(fā)酵效果的情況下,揮發(fā)酸含量最低。

圖3 pH對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.3 The effects of pH on volatile acidity of mulberry wine

2.4酵母接種量對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

在桑椹果酒發(fā)酵過(guò)程中,酵母接種量過(guò)少,達(dá)不到理想的發(fā)酵效果,接種量過(guò)高,酵母會(huì)消耗發(fā)酵液中的糖用于自身的生長(zhǎng)、繁殖,從而影響果酒的酒精含量[17]。另外,由于酵母菌自身生長(zhǎng)繁殖會(huì)消耗部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使酵母菌正常的酒精代謝途徑受到影響,從而形成揮發(fā)酸等產(chǎn)物。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

由圖4可知，當(dāng)酵母接種量不超過(guò)4%時(shí)，揮發(fā)酸和酒精度變化不大，當(dāng)接種量大于4%時(shí)，揮發(fā)酸迅速上升而酒精度降低。其原因可能是當(dāng)接種量較小時(shí)，酵母菌利用糖進(jìn)行正常的酒精發(fā)酵,當(dāng)接種量過(guò)高時(shí),酵母菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于自身的生長(zhǎng)、繁殖,生成揮發(fā)酸等產(chǎn)物,從而導(dǎo)致酒精度降低,揮發(fā)酸升高。因此結(jié)合揮發(fā)酸和酒精度含量,當(dāng)酵母菌接種量在4%左右時(shí),在保證桑椹果酒正常發(fā)酵效果的情況下,揮發(fā)酸含量最低。

圖4 酵母接種量對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.4 The effects of inoculum concentration on volatile acidity of mulberry wine

2.5正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表2與表3。

通過(guò)極差和方差分析,對(duì)桑椹果酒發(fā)酵結(jié)果影響大小依次為:pH、糖添加量、溫度、酵母接種量,pH對(duì)桑椹果酒影響顯著,從理論上得桑椹果酒最佳發(fā)酵工藝條件為:A3B3C2D2,即糖度180 g/L,溫度28 ℃,pH4.25,接種量4%。在理論最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),同時(shí)以正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組進(jìn)行對(duì)照,得理論最佳發(fā)酵工藝條件下桑椹果酒揮發(fā)酸為1.32 g/L,酒精度為10.5%vol,其綜合評(píng)分為0.93,優(yōu)于對(duì)照組的綜合評(píng)分0.89,從而得桑椹果酒最佳發(fā)酵工藝條件為A3B3C2D2。

2.6桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

在桑椹果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜鑒定最佳發(fā)酵工藝條件下桑椹果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分,以探究最佳發(fā)酵工藝對(duì)桑椹果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。GC-MS色譜圖如圖5所示,桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分如表4所示。

圖5 桑椹果酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.5 The total volatile components ion spectra of mulberry wine

表4 桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分Table 4 The volatile composition of mulberry wine

由表4可知,從桑椹果酒中共檢測(cè)出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中醇類物質(zhì)10種,是桑椹果酒中最主要的風(fēng)味物質(zhì),酯類物質(zhì)10種,其含量?jī)H次于醇類,其他揮發(fā)性物質(zhì)9種,三類物質(zhì)的相對(duì)含量分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的92.413%、5.315%、1.079%。醇類物質(zhì)中苯乙醇含量較高,賦予桑椹酒獨(dú)特的香氣,酯類物質(zhì)賦予桑椹酒濃郁的果香、花香,其中貢獻(xiàn)較大的是乙酸乙酯,辛酸乙酯和丙酸苯乙酯,這與商敬敏[18]等人確定的醇類、酯類為桑椹果酒中主要風(fēng)味成分的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在最佳工藝即糖度180 g/L,溫度28 ℃,pH4.25,酵母菌接種量4%條件下,在保證降低桑椹果酒揮發(fā)酸的情況下,桑椹果酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分豐富,桑椹果酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化取得了較好的效果。

3 結(jié)論

本文采用安琪酵母進(jìn)行桑椹果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),探究發(fā)酵條件對(duì)桑椹果酒中揮發(fā)酸的影響。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn),得到桑椹果酒最佳發(fā)酵工藝條件為:糖度180 g/L,溫度為28 ℃,pH4.25,酵母菌接種量4%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得桑椹果酒中揮發(fā)酸含量為1.32 g/L,酒精度達(dá)到10.5%vol,其綜合評(píng)分為0.93,將驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較,結(jié)果表明A3B3C2D2為最優(yōu)組合。通過(guò)對(duì)桑椹果酒揮發(fā)性

風(fēng)味成分的分析,在此條件下,果酒中主要的風(fēng)味成分為醇類和酯類,賦予桑椹酒獨(dú)特的果香和酯香。

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