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(1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西南昌 330031;2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西南昌 330031;3.中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

黃酮類化合物廣泛存在于自然界,是大多藥用植物的有效成分,普遍具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射和免疫調(diào)節(jié)等多種活性,是國(guó)內(nèi)外天然藥物開(kāi)發(fā)利用的研究熱點(diǎn)[1-2],但是多數(shù)黃酮苷元或黃酮苷類在水相中溶解度低,大大限制了其藥物制劑的開(kāi)發(fā),目前國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)去糖基化,對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行分子修飾以提高其在水相中的溶解性。對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然活性成分,利用化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾存在著得率低、反應(yīng)專一性差、副產(chǎn)物多等缺點(diǎn),特別是有些反應(yīng)目前利用化學(xué)手段較難實(shí)現(xiàn)。而生物轉(zhuǎn)化技術(shù)卻可彌補(bǔ)化學(xué)合成的不足,已經(jīng)報(bào)道許多研究人員篩選出來(lái)產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的菌株[3-5],這種酶可以將一些黃酮類化合物的末端糖基去掉以增加黃酮類化合物的水溶性和穩(wěn)定性,降低其細(xì)胞毒性[6]。

α-L-鼠李糖苷酶是一種水解末端鼠李糖糖苷的水解酶類,能高效、專一水解α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6位連接的糖苷鍵,可應(yīng)用于水解部分黃酮類化合物。α-L-鼠李糖苷酶來(lái)源廣泛,分布于動(dòng)物組織[7]、植物[8]、微生物[9-10]中。目前國(guó)內(nèi)對(duì)微生物產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的研究,主要集中在黑曲霉[11-13]上;國(guó)外研究主要涉及的菌種有黑曲霉、棘孢曲霉、白曲霉、青霉菌、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、熱微菌門(mén)和擬桿菌屬等[14-16]。

作者采用實(shí)驗(yàn)室前期篩選的1株黑曲霉[17]進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶,通過(guò)簡(jiǎn)單的硫酸銨鹽析,膜透析即可獲得α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液,同時(shí)對(duì)該粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入探討。后期該粗酶液對(duì)蘆丁進(jìn)行去糖基化得到異槲皮素(Isoquercitrin),同時(shí)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉 實(shí)驗(yàn)室篩選菌株;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%,上海源葉生物有限公司;酵母提取物、蛋白胨 美國(guó)OXOID公司;瓊脂粉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS) solarbio公司;甘氨酸、透析袋 Acros公司;考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS上樣緩沖液、蛋白質(zhì)marker(200 kDa) Takara公司,其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SPD-15C型高效液相色譜儀 日本島津有限公司;TGL-16C型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;M3型電熱循環(huán)水浴鍋 德國(guó)LAUDA公司;mLS-3750型滅菌鍋 日本SANYO公司;HWY-200型全溫?fù)u床 常州諾基儀器有限公司;SW-CT-1D型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;2720型PCR儀 美國(guó)ABI有限公司;DYY-10C型垂直電泳儀 北京六一儀器廠;Gel Doe XR型膠掃描系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基(g/L):KNO31.5,MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,無(wú)水CaCl20.1,酵母膏2.0,蘆丁2.5,瓊脂15。初始pH6.0,121 ℃滅菌20 min,倒平板。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):KNO31.5,MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,無(wú)水CaCl20.1,酵母膏2.0,蘆丁2.5。初始pH6.0,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 將黑曲霉接種斜面培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)5 d,待斜面上長(zhǎng)滿黑褐色孢子,用接種針挑取孢子,用0.9%的生理鹽水洗滌數(shù)次,然后30 ℃振蕩培養(yǎng)2 h,配成懸濁液,按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.3 粗酶液的制備 取發(fā)酵液于4 ℃、3000×g離心10 min后,取上清液。緩慢取50 mL的上清液加入(NH4)2SO4粉末至其飽和度70%,邊添加邊攪拌,4 ℃靜置過(guò)夜,然后4 ℃、8000×g冷凍離心20 min,得到的沉淀用一定體積HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)溶解。置于透析袋中,4 ℃透析2 d,每隔4 h換一次透析液。透析完畢,取出透析液,所得到的袋內(nèi)的透析液即為粗酶液。

1.2.4 酶蛋白分子量測(cè)定 采用SDS-PAGE法測(cè)定酶蛋白分子量。分離膠和濃縮膠濃度分別為10%和5%,上樣量為20 μL。先用80 V電泳30 min,再用120 V電泳90 min。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色45 min,過(guò)夜脫色。

1.2.5 酶活的測(cè)定 分別配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液,用HPLC檢測(cè),記錄峰面積,做異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC條件:分離柱為4.6 mm×250 mm Hypersil ODS 5 μm,流動(dòng)相為 甲醇:0.1%三氟乙酸水溶液=40∶60,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm,柱溫30 ℃。取pH5.5的HAC-NaAC緩沖液溶液2.0 mL于試管中,加入1 mL粗酶液,在40 ℃下水浴保溫5 min,再加入2.0 mL 300 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,在55 ℃下水浴反應(yīng)45 min后于沸水中滅活20 min,取出后迅速冷卻至室溫,用HPLC測(cè)定異槲皮素的峰面積,計(jì)算生成物含量。酶活定義,在上述條件,每分鐘生成1 μg異槲皮素所需要的酶量定義為一個(gè)酶活(U/mL)。

1.3α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 粗酶液的最適溫度 取2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液,加入2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與1 mL粗酶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測(cè)定異槲皮素的含量,計(jì)算相對(duì)酶活,相對(duì)酶活=實(shí)際測(cè)得酶活/實(shí)驗(yàn)中最大酶活。根據(jù)相對(duì)酶活的大小,確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.2 粗酶液的熱穩(wěn)定性研究 分別取1 mL的α-L-鼠李糖苷酶分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下保溫2 h后,取出與2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液和2 mL HAc-Nac緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測(cè)定異槲皮素的含量,比較酶經(jīng)過(guò)不同溫度處理后的相對(duì)酶活,確定其熱穩(wěn)定性。

1.3.3 粗酶液的最適pH 取2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液,加入2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與1 mL酶液在pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0的條件下進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測(cè)定異槲皮素的含量,計(jì)算相對(duì)酶活,確定酶的最適pH。

1.3.4 粗酶液的pH穩(wěn)定性研究 分別取1 mL的α-L-鼠李糖苷酶分別置于pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下,靜置2 h后,取出與2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液和2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測(cè)定異槲皮素的含量,計(jì)算相對(duì)酶活,比較酶經(jīng)過(guò)不同pH緩沖液處理后的相對(duì)酶活,確定其pH穩(wěn)定性。

1.4蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化

1.4.1 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) 稱取0.50 g 蘆丁制成40 mL的懸濁液,加入40 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與10 mL的酶液混合,于55 ℃反應(yīng)45 min后,用沸水終止反應(yīng)。取反應(yīng)液進(jìn)行薄層色譜分析,并與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照,展開(kāi)劑比例為乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸∶甲醇=5∶3∶1∶1。并用HPLC分別測(cè)定反應(yīng)液中蘆丁和異槲皮素的峰面積,計(jì)算蘆丁的轉(zhuǎn)化率。

1.4.2 產(chǎn)物的分離純化 將反應(yīng)液蒸干,于真空干燥箱過(guò)夜。硅膠經(jīng)烘干預(yù)處理后干法裝入層析柱(2.0 cm×50 cm)中,壓緊。準(zhǔn)確稱取一定量的反應(yīng)物粗提物溶解于少量的洗脫劑(洗脫劑比例為乙酸乙酯∶甲醇=8∶1)中,加到柱上方,再泵入洗脫劑進(jìn)行柱層析。并開(kāi)始計(jì)時(shí)、取樣。TLC跟蹤檢測(cè),進(jìn)行分段收集。含有異槲皮素的洗脫液合并蒸干,測(cè)定含量,計(jì)算蘆丁的轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的蘆丁/總蘆丁。

1.5產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

取大約10 μg樣品溶于1 mL色譜級(jí)甲醇中,振蕩搖勻,交給南昌大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行質(zhì)譜分析(LC-MS,一級(jí)質(zhì)譜);同時(shí)取10 mg樣品(粉末狀態(tài))放在核磁管中,交給南昌大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行1HNMR分析。2 d后返回質(zhì)譜和氫譜結(jié)果,并結(jié)合譜圖進(jìn)行分析確認(rèn)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少設(shè)3次重復(fù),采用SPSS V21.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1酶蛋白分子量與酶活測(cè)定

2.1.1 酶蛋白分子量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道α-L-鼠李糖苷酶的分子量在40～170 kDa之間[18-21],本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE方法測(cè)定粗酶液的分子量,如圖1所示,泳道1為蛋白marker,泳道2為粗酶液,通過(guò)SDS-PAGE蛋白質(zhì)遷移率實(shí)驗(yàn)計(jì)算得蛋白質(zhì)分子量為58.1 kDa。

圖1 粗酶的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of crude enzyme.注:泳道1.蛋白marker；2.粗酶液。

2.1.2 酶活的測(cè)定 分別配制不同濃度的異槲皮素,利用HPLC測(cè)定各濃度異槲皮素的峰面積,根據(jù)峰面積與異槲皮素的濃度關(guān)系,做異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。反應(yīng)結(jié)束后,用HPLC測(cè)定異槲皮素的峰面積,其峰面積為9.85×106,所以反應(yīng)液中異槲皮素的濃度為0.798 mg/mL。通過(guò)計(jì)算得到粗酶液酶活為798 U/mL。

圖2 異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Curve of isoquercetin

2.2α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 溫度對(duì)酶活的影響 酶催化的反應(yīng)速率與溫度密切相關(guān),因此溫度是α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究的重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道,不同來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶,其最適反應(yīng)溫度也各不相同,但多在30～60 ℃[19-23]。將純化后得到的α-L-鼠李糖苷酶在不同溫度(30～80 ℃)下進(jìn)行酶活性測(cè)定,結(jié)果如圖3所示:當(dāng)溫度由30～55 ℃逐步上升時(shí),酶的活力隨著溫度的升高逐漸增強(qiáng),到55 ℃時(shí),酶活力最高,而55 ℃之后,隨著溫度的升高,酶的活力逐漸降低,當(dāng)溫度增加到80 ℃以上時(shí),酶全部失活。因此,根據(jù)以上數(shù)據(jù),可以確定酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃。

圖3 α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度Fig.3 The optimal reaction temperature of alpha-L-rhamnosidase

2.2.2 酶的熱穩(wěn)定性研究 為了進(jìn)一步研究溫度對(duì)α-L-鼠李糖苷酶穩(wěn)定性的影響,將酶液于20～80 ℃條件下保溫2 h后,進(jìn)行酶活力的測(cè)定,結(jié)果如圖4所示:α-L-鼠李糖苷酶在20～40 ℃條件下保溫,酶活力下降不明顯,能保持在原酶活的85%以上;而當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí),酶活力迅速下降迅速下降;在80 ℃時(shí),粗酶液幾乎全部失活。

圖4 α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 The temperature stability of alpha-L-rhamnosidase

圖5 α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)pHFig.5 The optimal reaction pH of alpha-L-rhamnosidase

2.2.3 pH對(duì)酶活的影響 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,α-L-鼠李糖苷酶的最適pH大部分在4.5～6.0之間[19-23],用pH4.0～8.0的緩沖溶液(10 mmol/L)配制底物和稀釋酶液,檢測(cè)pH對(duì)α-L-鼠李糖苷酶活性的影響,得到如圖5所示:α-L-鼠李糖苷酶屬于酸性酶,其中pH在4.0～5.5時(shí),酶活快速增大,pH為5.5時(shí),酶活達(dá)到最大,pH大于5.5時(shí),酶活迅速降低。因此,可以確定,酶反應(yīng)的最適pH為5.5。

2.2.4 酶的酸堿穩(wěn)定性研究 酶液置于pH2.0～9.0 的緩沖液(10 mmol/L)中24 h后,測(cè)定pH對(duì)α-L-鼠李糖苷酶穩(wěn)定性的影響。如圖6所示,在pH小于5.0 和pH大于6.5時(shí),可能由于α-L-鼠李糖苷酶發(fā)生了失活現(xiàn)象,因此酶活性急劇降低。

圖6 α-L-鼠李糖苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 The pH stability of alpha-L-rhamnosidase

2.3蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)及產(chǎn)物分離純化

2.3.1 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) 通過(guò)酶解產(chǎn)物與異槲皮素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析圖譜,如圖7所示,蘆丁在實(shí)驗(yàn)所得高純度α-L-鼠李糖苷酶的作用下,幾乎全部轉(zhuǎn)化生成了唯一產(chǎn)物[24-26],其中蘆丁的遷移率Rf為0.29,異槲皮素的遷移率Rf為0.72,產(chǎn)物的遷移率Rf為0.72,Rf=點(diǎn)樣基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離/從基線到展開(kāi)前沿的距離。因此可初步確定其反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)為異槲皮素。

圖7 反應(yīng)產(chǎn)物TLC分析Fig.7 The reaction products of TLC注:1.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；2.異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品；3.產(chǎn)物。

為了進(jìn)一步檢測(cè)異槲皮素的產(chǎn)率,進(jìn)行HPLC檢測(cè),檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中的蘆丁與異槲皮素的情況。圖譜如圖8所示,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是7.824 min,異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是8.633 min,如圖9所示,反應(yīng)產(chǎn)物出峰時(shí)間是8.537 min。根據(jù)HPLC圖譜的峰面積,異槲皮素的含量高達(dá)95%。因此,可以判斷酶解生成的產(chǎn)物應(yīng)為異槲皮素,也進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)純化獲得的α-L-鼠李糖苷酶具有良好的酶解效果,專一性好且轉(zhuǎn)化率高。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.8 HPLC of standard map

圖9 反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.9 HPLC of reaction products

2.3.2 產(chǎn)物的分離純化 將柱層析得到的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析,如圖10所示:一共出現(xiàn)3個(gè)峰型,ESI-MS m/z(%):464.09[M]+,927.19、435.13。其中464.09可以確定是異槲皮素的相對(duì)分子質(zhì)量,其核磁氫譜如圖11所示。

圖10 產(chǎn)物的質(zhì)譜分析Fig.10 MS of the products

圖11 產(chǎn)物的核磁氫譜分析Fig.11 NMR of the products

1H-NMR(CH3DO,600 MHz)δ:7.709(d,1H),7.589(1H,dd),6.873(1H,d),6.873(1H,d),6.392(1H,d),6.200(1H,d),5.257(1H,d),4.848(1H,s),3.723(1H,dd),3.587(1H,m),3.494(1H,t),3.331(1H,t),3.209(1H,m)。

3 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶,該粗酶液的酶活達(dá)到了798 U/mL;利用α-L-鼠李糖苷酶將蘆丁轉(zhuǎn)化為異槲皮素,傳統(tǒng)方法制備異槲皮素需要高溫高壓,對(duì)設(shè)備要求高,該方法比傳統(tǒng)的化學(xué)法有更多優(yōu)勢(shì),反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)時(shí)間短,對(duì)底物的選擇性強(qiáng),并且反應(yīng)過(guò)程容易控制,轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%。同時(shí)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究,酶蛋白的分子量為55 kDa,酶反應(yīng)的最適溫度是55 ℃,最適pH是5.5。通過(guò)酶法水解蘆丁,為實(shí)現(xiàn)異槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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