, ,,,,*

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林延吉 133000;2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林延吉 133000)

肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC,簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤,地球上發(fā)病率排第6位,死亡率為癌癥譜的前三位[1]。研究發(fā)現(xiàn),多種信號(hào)通路參與肝細(xì)胞的增殖與凋亡[2],而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)。PI3K/Akt作為調(diào)節(jié)Bcl-2家族的主要通路之一,調(diào)節(jié)Bcl-2家族的磷酸化水平,從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[3-4]。

民族傳統(tǒng)中藥草蓯蓉又稱不老草,具有補(bǔ)腎壯陽、滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效。草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷(Iridoid glycosides from Boschniakia rossica,IGBR)是草蓯蓉重要活性成分,具有抗癌、誘導(dǎo)凋亡、清除自由基、保肝等作用[5-6]。本課題組以往主要是在大鼠肝癌癌前病變的模型中研究IGBR對細(xì)胞凋亡的作用,而其在體外(細(xì)胞培養(yǎng))實(shí)驗(yàn)中是否可以通過細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的凋亡,目前尚未研究。

本課題組前期研究表明,當(dāng)IGBR直接作用于肝癌細(xì)胞時(shí),雖然有一定的抑制作用,但細(xì)胞存活率仍無顯著差異,有90%以上的肝癌細(xì)胞繼續(xù)保持生長。本實(shí)驗(yàn)通過給Wistar雄性大鼠灌胃IGBR來制備IGBR含藥血清,觀察其誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及在這一過程中細(xì)胞凋亡相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)通路的作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

Wistar雄性大鼠體重(180±20) 延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(吉)2011-0007);IGBR 由延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室全吉淑教授惠贈(zèng);5-氟尿嘧啶(5-FU) 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司;人肝癌SMMC-7721細(xì)胞 由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供;DMEM/HIGH GLUCOSE 美國HyClone公司;Penicilin-Streptomycin Solution 美國Gen DEP OT公司;Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit 美國Promega公司;Dimethyl sulfoxide(DMSO) 美國Sigma公司;FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I 美國BD Biosciences公司;RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司;胎牛血清 美國Gibco公司;AO/BE雙染色試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;抗Bax、Bcl-2多克隆抗體 北京中杉金橋公司;β-actin、兔抗人Akt、p-Akt抗體 Cell Signaling Technology公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 美國Thermo Scientific。

Neubauer-improved型細(xì)胞計(jì)數(shù)板 德國Marienfeld;BioTek Eon微孔板分光光度計(jì) 北京拜西歐斯生物技術(shù)有限公司;IX70-1120倒置顯微鏡 OLYMPUS公司;CO2培養(yǎng)箱 Thermo公司;無菌超凈臺(tái) BIOAIR公司;PVDF膜 美國BioRad公司;Tlot轉(zhuǎn)印槽 美國Bio Rad公司;凝膠顯像儀 美國Protein Simple公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,每2～3 d傳代一次,取對數(shù)生長期(7 d)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。

1.2.2 藥物血清制備 將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、5-FU組、IGBR低、中、高劑量組每組6只;對照組給予生理鹽水2 mL灌胃;5-FU組按照75 mg/kg的劑量灌胃5-FU;IGBR組分別以125、250、500 mg/kg的劑量給予大鼠灌胃IGBR,每天一次,連續(xù)用藥1 月后,處死各組大鼠,取心臟血(各組6 只大鼠血清的混合物)經(jīng)3000 r/min,離心20 min,56 ℃恒溫箱中水浴30 min用以滅活血清中補(bǔ)體等活性成分,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞活力 將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞加入96 孔板中,100 μL懸液內(nèi)含1×103個(gè)細(xì)胞,共200 μL;24 h后吸棄培養(yǎng)液,加入含不同終濃度IGBR無血清細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL,處理不同時(shí)間后吸去培養(yǎng)液。設(shè)置陰性對照組(只加等量二甲基亞砜(DMSO))、空白對照組(只加等量培養(yǎng)液)和實(shí)驗(yàn)組;培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入20 μL MTT(以無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋,終濃度為0.5 mg/mL),放入5% CO2,37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min;加入200 μL DMSO;振蕩器振蕩10 min,充分溶解;酶標(biāo)儀波長490 nm測吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/陰性對照組OD×100

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞(5×105個(gè)/培養(yǎng)瓶),進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。除對照組,5-FU、IGBR分別作用24 h后收獲細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗肝癌細(xì)胞加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,置于室溫下,避光10 min;加入5 μL Annexun V-FITC和5 μL PI Staining Solution,混勻;加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻;流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后檢測蛋白濃度,配制5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5～2.0 h,分別加入1∶500稀釋的一抗Akt和p-Akt抗體、抗Bax和Bcl-2多克隆抗體,4 ℃過夜(12 h);加入1∶1000稀釋的二抗,室溫下孵育2～3 h,TBS洗膜3次后,ECL發(fā)光液滴加在PVDF膜上,采用凝膠成像系統(tǒng)成像。PI3K抑制劑LY294002作用細(xì)胞以20 μmol/L濃度孵育30 min后,再以80 μmol/L IGBR藥物血清處理細(xì)胞48 h,檢測LY294002對凋亡特征性蛋白的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1IGBR藥物血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞活力的影響

由表1可知,IGBR藥物血清可降低人肝癌SMMC-7721細(xì)胞活力,并呈濃度和時(shí)間依賴性。5-FU(75 mg/kg)和低(125 mg/kg)、中(250 mg/kg)、高(500 mg/kg)濃度IGBR灌胃后取得的含藥血清作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力分別降低為75%、88%、85%和80%,與對照組相比差異顯著(p<0.05);而作用48 h后,細(xì)胞活力分別降低為52%、66%、65%和62%,與對照組相比差異顯著(p<0.05)。

表1 5-FU和IGBR含藥血清對SMMC-7721肝癌細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effects of serum containing 5-FU and IGBR on the survival rate of SMMC-7721 hepatoma cells

圖1 給藥48 h后人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的檢測Fig.1 After administration of 48 h,the cell apoptosis rate was detected by SMMC-7721

注:*與對照組比較,p<0.05;#與對照組比較,p<0.05。2.2IGBR含藥血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,IGBR作用48 h后,與對照組比較,5-FU組與IGBR組凋亡率升高(p<0.05),兩組間無顯著差異(p>0.05),IGBR組隨給藥劑量的增加其凋亡程度加重,見圖1。

2.3IGBR含藥血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

PI3K/Akt通路在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要的作用，本研究也探討了IGBR含藥血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響，由圖2可知,5-FU組和IGBR組人肝癌SMMC-7721細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)降低,與對照組相比差異顯著(p<0.05),隨著IGBR含藥血清濃度的增加,p-Akt蛋白表達(dá)逐漸減少,但不影響總Akt蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果可知，IGBR含藥血清可純化人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的PI3K/Akt通路。

圖2 IGBR處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞p-Akt、Akt蛋白表達(dá)量Fig.2 The expression of p-Akt and Akt protein in SMMC-7721 cells treated with IGBR(±s,n=3)注:*與對照組比較,p<0.05;#與對照組比較,p<0.05;圖3同。

2.4IGBR含藥血清對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

以不同濃度IGBR含藥血清處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,Western blot檢測結(jié)果顯示,5-FU組和IGBR組Bax表達(dá)水平升高,而Bcl-2表達(dá)水平降低,與對照組相比顯著差異(p<0.05),但兩組間無顯著差異(p>0.05),且隨著IGBR含藥血清濃度的增加,上述變化更明顯,見圖3。

圖3 IGBR處理對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of IGBR treatment on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in SMMC-7721 cells(±s,n=3)

2.5IGBR含藥血清聯(lián)合抑制劑對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

用PI3K/Akt信號(hào)通路特異性的抑制劑LY294002作用于細(xì)胞后,與對照組相比,抑制劑單獨(dú)作用后p-Akt蛋白表達(dá)降低,Bax與Bcl-2比值增加(p<0.05),而抑制劑與IGBR聯(lián)合作用后p-Akt蛋白表達(dá)量顯著降低,Bax與Bcl-2比值顯著增加(p<0.05),見圖4。研究證明,PI3K/Akt信號(hào)通路參與了IGBR誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。

圖4 IGBR聯(lián)合抑制劑處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞p-Akt/Akt、Bax/Bcl-2相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression of p-Akt/Akt and Bax/Bcl-2 in SMMC-7721 cells treated with IGBR combined inhibitor注:#與對照組比較,p<0.05;Δ與對照組比較,p<0.05;#Δ與對照組比較,p<0.05。

3 討論

P13K/Akt信號(hào)通路通過影響其下游多種效應(yīng)分子而發(fā)揮抗凋亡作用。PI3K/Akt及其相關(guān)蛋白經(jīng)過基因或抑制劑的干預(yù),可阻止下游抗凋亡基因的活化,而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,目前成為研究腫瘤治療的焦點(diǎn)[8]。PI3K/Akt信號(hào)通路激活參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展,也是肝癌發(fā)生、發(fā)展中一個(gè)主要調(diào)節(jié)途徑。PI3K/Akt信號(hào)通路被活化后促進(jìn)細(xì)胞增殖存活,抑制細(xì)胞凋亡,加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。PI3K使Akt激活后,磷酸化下游底物,影響細(xì)胞分裂、生存、代謝等[11-12]?；罨腁kt能夠通過磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。磷酸化Akt具有生物活性,可通過磷酸化凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-9和一些蛋白激酶來進(jìn)一步控制細(xì)胞凋亡[13-16]。

Bcl-2家族成員定位于胞質(zhì)或細(xì)胞骨架,遇到死亡信號(hào)后改變構(gòu)象,轉(zhuǎn)位于線粒體外膜上,受上游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)可發(fā)生Bax表達(dá)升高,構(gòu)象改變、BAD和Bik的磷酸化失活等,影響凋亡相關(guān)蛋白的平衡、線粒體的結(jié)構(gòu)與功能,決定細(xì)胞生死[17]。PI3K/Akt信號(hào)通路可影響B(tài)cl-2家族的構(gòu)象或二聚體的形成等,從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[4,18]。研究表明,細(xì)胞凋亡的發(fā)生受多種基因的調(diào)控,其中Bax和Bcl-2備受關(guān)注,且其比值決定細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后存活與否,在調(diào)控凋亡中起關(guān)鍵作用[19-21]。Bax為凋亡促進(jìn)蛋白,Bcl-2為凋亡抑制蛋白,細(xì)胞中Bax升高則形Bax同源二聚體,加速凋亡;反之形成Bax/Bcl-2異源二聚體,而抑制凋亡[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IGBR含藥血清可降低人肝癌SMMC-7721細(xì)胞活力,誘導(dǎo)其凋亡,并呈濃度依賴性。IGBR含藥血清干預(yù)后,人肝癌SMMC-7721細(xì)胞p-Akt、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下降,Bax蛋白的表達(dá)水平增加,而總Akt蛋白未見明顯變化。進(jìn)一步研究表明IGBR含藥血清能夠抑制磷酸化Akt的表達(dá),抑制劑LY294002 促進(jìn)了磷酸化Akt的減少;這些證據(jù)都表明PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)了IGBR含藥血清誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。另外,本實(shí)驗(yàn)檢測到Bax/Bcl-2比值受IGBR含藥血清誘導(dǎo)后增加,證明IGBR含藥血清確實(shí)通過Bcl-2家族誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,本研究通過MTT法、流式細(xì)胞義檢測和Western blot檢測表明IGBR含藥血清可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖,抑制Akt蛋白磷酸化作用;并通過PI3K/Akt信號(hào)通路參與Bax及Bcl-2蛋白的調(diào)控,IGBR誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。

總之,肝癌細(xì)胞生長中有復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)著腫瘤的生長、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。利用細(xì)胞信號(hào)通路探尋阻斷腫瘤形成的機(jī)制,為肝癌的診治帶來新的契機(jī),進(jìn)而為積極開展臨床實(shí)驗(yàn),研發(fā)中藥抗癌藥提供科學(xué)依據(jù)。

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