,,,3,*,,3

(1.南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014;3.國家蔬菜加工技術研發(fā)分中心,江蘇南京 210014)

南瓜(CucurbitamoschataDuch)是雙子葉植物門葫蘆科南瓜屬植物,在世界各地都有廣泛種植[1]。南瓜加工副產物-南瓜皮和南瓜籽約占整個南瓜的10%～40%,通常被作為廢棄物處理,但南瓜皮中含有豐富的葉黃素(0～17 mg/100 g FW)[2],其主要以葉黃素酯的形式存在,不易被人體吸收,需要經過提取、皂化處理才能獲得人體所能吸收的游離態(tài)葉黃素。

圖1 反式葉黃素及葉黃素順式異構體 Fig.1 All trans utein and its cis isomers

醫(yī)學研究表明,葉黃素具有比β-胡蘿卜素更優(yōu)良的抗氧化性能,能抵御自由基在人體內造成的細胞與器官損傷,還能減少某些慢性疾病如癌癥、心臟病、II型糖尿病等的發(fā)病[3-4]。然而,由于葉黃素分子中含多個共軛碳碳雙鍵,使其具有多種異構體(圖1)。研究發(fā)現(xiàn),在生物體內反式葉黃素的生物活性較其順式異構體高很多[5]。因此,優(yōu)化南瓜皮提取過程,提高制品中反式葉黃素的含量、減少順式異構體的形成,是研究需要解決的問題。

近年來,超聲波提取作為一種頗具優(yōu)勢的提取方法,逐漸應用于天然植物活性成分的提取中[6-9],其主要利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成份的浸出[10]。盡管超聲波提取具有提取溫度低、提取效率高、提取時間短的獨特優(yōu)勢,但不當?shù)某晽l件也可能導致葉黃素的降解和異構化[11-12]。因此,本研究以南瓜皮為原料,利用超聲波提取其中的葉黃素,通過考察各因素對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響,采用響應面法優(yōu)化南瓜皮中葉黃素的提取工藝條件,以期獲得適宜的提取方法,為葉黃素的高效提取及南瓜皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

“蜜本”南瓜(CucurbitamoschataDuch. cv.Miben) 江蘇省南京市孝陵衛(wèi)農貿市場,取南瓜皮,經冷凍干燥、粉碎過40目篩后,制成南瓜皮粉(水分含量為3.56%±0.08%,w/w),冷藏備用;反式葉黃素標準品 純度97%,CAS#:X6250 美國Sigma公司;甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)、甲醇(均為色譜純) 美國天地公司;純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;氮氣(純度99.99%) 南京文達特種氣體有限公司;其他試劑均為分析純。

1200高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) 美國安捷倫科技有限公司;6530精確質量數(shù)四級桿-飛行時間質譜儀(6530 Q-TOF) 美國安捷倫科技有限公司;KQ-300GVDV臺式三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器公司;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE-52A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;MD 200氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 超聲提取 參考付莉等[2]的方法并稍作修改,準確稱取0.50 g南瓜皮粉置于50 mL具塞三角瓶中,按適量液固比加入一定體積比的提取試劑,在超聲頻率為45 kHz,在一定的超聲功率下提取一段時間,采用冷卻水循環(huán)控制水浴溫度為室溫。待提取結束后,將提取液抽濾,于4000 r/min下離心10 min,收集上清液。

參考胡建中等[13]的方法并稍作修改,向15 mL上清液中加入2 mL 40% KOH-甲醇溶液,搖勻后置于暗處25 ℃皂化12 h,轉移至分液漏斗,加入30 mL正己烷,振蕩1 min,再加入38 mL 10%硫酸鈉溶液,收集上層溶液,45 ℃旋轉蒸發(fā),氮氣吹干,獲得南瓜皮葉黃素提取物。所有操作均在避光環(huán)境下完成。

1.2.2 反式葉黃素及其順式異構體分析 用5 mL甲醇復溶南瓜皮葉黃素提取物,并進行高效液相色譜-二極管陣列檢測-大氣壓化學電離質譜分析[11,14]。

1.2.2.1 C30-HPLC-DAD-MS分析條件 HPLC分析條件:YMC-C30色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A為水-MTBE-甲醇(5∶25∶75,V/V/V),B為水-MTBE-甲醇(5∶85∶10,V/V/V);洗脫梯度設置:0～4.5 min,95%→80% A;4.5～12.5 min,80%→50% A;12.5～18 min,50%→25% A;18～24 min,25%→5%A;24～30 min,5%→95% A;二極管陣列檢測器,檢測波長:450 nm;流速:0.6 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:25 ℃。

MS條件:色譜柱流出組分進入質譜儀的流速為10 μL/min;離子源:APCI+;掃描范圍:m/z 80～1000;毛細管電壓:2500 V;干燥氣體:5 L;霧化氣體:20 psi;氣化溫度:350 ℃;蒸汽溫度:400 ℃;電暈電流:4 μA。

1.2.2.2 反式葉黃素標準曲線繪制 精確稱取1.0 mg反式葉黃素標準品,用甲醇溶解并定溶于25 mL棕色容量瓶,混勻,制成質量濃度為40 μg/mL的標準液。分別取一定量標準液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容并混勻,制成濃度2、4、6、8、10、20 μg/mL的系列標準溶液,按照1.2.2.1 HPLC分析條件,每個系列濃度進樣3次,以反式葉黃素系列標準液質量濃度為橫坐標、相應吸收峰面積為縱坐標,繪制反式葉黃素標準曲線,得到回歸方程Y=28.14X+104.14,R2=0.9991。

1.2.2.3 南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體定性定量分析方法 對于南瓜皮中的反式葉黃素,可對照反式葉黃素標準品的色譜圖,根據(jù)其保留時間的一致性定性鑒定,再根據(jù)峰面積大小,由所繪制的反式葉黃素標準曲線,計算其含量;由于葉黃素順式異構體沒有相應的標準品,因此利用其特征吸收波長、紫外-可見光譜特性、順式吸收強度(Q值,順式吸收峰“高度值”與最大吸收波長“高度值”之比)以及質譜離子碎片特性[15-16]進行定性分析,再通過替換計算法[15]對葉黃素順式異構體進行定量測定。葉黃素提取量計算公式如下:

式中:C-葉黃素提取量,μg/g dw;Y-吸收峰面積;l-復溶溶劑體積,mL;m-樣品質量,g。

1.2.3 南瓜皮葉黃素提取溶劑的選擇 在查閱國內外大量參考文獻[17-21]的基礎上,選取5種文獻報道中的葉黃素提取最佳溶劑,分別為正己烷-乙醇-丙酮-甲苯(10∶6∶7∶7,V/V/V/V:)、丙酮-石油醚(2∶1,V/V)、無水乙醇、氯仿-乙醇(3∶2,V/V)及乙醇-石油醚(2∶1,V/V),按照1.2.1所述工藝,固定參數(shù):超聲功率210 W,液固比30∶1 mL/g,提取時間30 min,提取南瓜皮中葉黃素,比較不同試劑對提取物中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響,獲得南瓜皮葉黃素的最佳提取溶劑。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 溶劑比例對南瓜皮中葉黃素提取量的影響 按照1.2.1項下方法,參考文獻[2]中的方法,設置乙醇/石油醚體積比分別為2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、2∶5,于超聲功率210 W,提取時間30 min,液固比30∶1 mL/g條件下進行實驗,考察乙醇/石油醚體積比對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響。

1.2.4.2 超聲功率對南瓜皮中葉黃素提取量的影響 按照1.2.1項下方法,參考文獻[2]中的方法,設置超聲功率分別為150、180、210、240、270 W,于乙醇/石油醚體積比2∶1,提取時間30 min,液固比30∶1 mL/g條件下進行實驗,考察超聲功率對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響。

1.2.4.3 液固比對南瓜皮中葉黃素提取量的影響 按照1.2.1項下方法,參考文獻[2]中的方法,設置液固比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g,于乙醇/石油醚體積比2∶1,超聲功率180 W,提取時間30 min條件下進行實驗,考察液固比對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響。

1.2.4.4 提取時間對南瓜皮中葉黃素提取量的影響 按照1.2.1項下方法,參考文獻[2]中的方法,設置提取時間分別為20、30、40、50、60 min,于乙醇/石油醚體積比2∶1,超聲功率180 W,液固比35∶1 mL/g條件下進行實驗,考察提取時間對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響。

1.2.5 響應面法實驗設計 在單因素實驗的基礎上,運用 Design Expert 8.0.6軟件,選取三個主要因子:超聲功率(x1)、提取時間(x2)、液固比(x3),采用中心組合實驗設計(Face-centred Central Composite design,FCCD),以反式葉黃素提取量(Y1)、葉黃素順式異構體提取量(Y2)為響應值進行三因素三水平的中心組合實驗并對結果進行分析,實驗設計編碼值如表1所示。

表1 中心組合實驗因素水平表Table 1 Levels and factors of central composite experiments

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1南瓜皮中的葉黃素鑒定

采用C30-HPLC-DAD-MS方法測定了南瓜皮葉黃素提取物中的主要成分,結果如圖2所示。通過與標準品比對,結合光譜圖(圖3)、質譜圖(圖4)與相關文獻[21-22]共鑒定出1種反式葉黃素及4種葉黃素順式異構體(9-順式葉黃素,9′-順式葉黃素,13/13′-順式葉黃素,15-順式-葉黃素)。由于13-順式葉黃素與13′-順式葉黃素相似的光譜性質,本研究未能分離鑒定。

基于此,本研究進一步考察超聲提取過程中各因素對南瓜皮中葉黃素及其順式異構體的影響。

圖2 南瓜皮中葉黃素提取物的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatograms of lutein and its cis isomers in extract of pumpkin peels注:峰1為15-順式葉黃素,峰2為13/13′-順式葉黃素,峰3為反式葉黃素,峰4為9-順式葉黃素,峰5為9′-順式葉黃素，圖3同。

圖3 反式葉黃素及其順式異構體的光譜圖Fig.3 Spectrum overlays of trans lutein and its cis isomers

圖4 反式葉黃素及其順式異構體的質譜圖Fig.4 Positive ion APCI mass spectra of trans lutein and its cis isomers

2.2南瓜皮葉黃素最佳提取溶劑的確定

研究比較了正己烷-乙醇-丙酮-甲苯、丙酮-石油醚、無水乙醇、氯仿-乙醇及乙醇-石油醚5種提取溶劑對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響,結果見表2,從表中可以看出不同溶劑之間反式葉黃素提取量存在顯著差異(p<0.05),其中乙醇-石油醚(2∶1,V/V)提取反式葉黃素的提取量最高,達到(116.5±0.9)μg/g dw,而無水乙醇提取效率最差,可能是因為乙醇是強極性溶劑,石油醚是弱極性溶劑,二者的介電常數(shù)相差較大,混合后溶劑極性改變范圍也較大,更容易與葉黃素的極性接近,提高了萃取葉黃素的能力[17];而對于葉黃素順式異構體而言,乙醇-石油醚(2∶1,V/V)的提取量與正己烷-乙醇-丙酮-甲苯(10∶6∶7∶7,V/V/V/V)和丙酮-石油醚(2∶1,V/V)的提取量之間均無顯著差異。此外,乙醇和石油醚價格便宜均較易獲得,且乙醇和石油醚沸點較低,后續(xù)的分離提純工序中容易除去。因此,綜合考慮反式葉黃素提取效率及溶劑的安全性,本實驗選取乙醇-石油醚混合溶劑作為南瓜皮中葉黃素的提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對南瓜皮葉黃素提取量的影響Table 2 Effects of different solvents on extraction efficiency of lutein from pumpkin peel

注:不同小寫字母表示不同溶劑提取葉黃素之間存在顯著性差異(p<0.05)。

2.3單因素實驗結果分析

2.3.1 溶劑比例的影響 由圖5a可知,當乙醇與石油醚體積比分別為2∶1和2∶2時,南瓜皮中反式葉黃素提取量沒有顯著性差異(p>0.05)。隨著石油醚比例的進一步增加,反式葉黃素提取量逐漸減少,原因可能是由于增加石油醚比例,混合溶劑的極性下降,脂溶性雜質溶出增多,與反式葉黃素競爭溶劑,導致反式葉黃素溶出率降低[23]。另一方面,由于石油醚揮發(fā)度較高,具有較高的溶劑蒸汽壓,當溶劑蒸汽進入空化泡后為空化泡的破裂提供緩沖作用,減少了沖擊力和剪切力[24],使反式葉黃素降解速率減小,順式異構體一直呈下降趨勢,綜合考慮反式葉黃素提取效率及溶劑安全性,溶劑比例選擇乙醇-石油醚為2∶1較為合適。

2.3.2 超聲功率的影響 由圖5b可以看出,超聲功率150～270 W范圍內,南瓜皮中反式葉黃素提取量隨超聲功率的增大先增加后減小。說明低功率超聲波對葉黃素的輔助浸出作用有限,李剛剛等[25]的研究中也發(fā)現(xiàn)功率過低不能充分提取葉黃素,而在高功率超聲波作用下,其空化效應和機械作用增強[16],葉黃素溶出速率增加,但超聲功率過大,導致反式葉黃素異構化[26],因此葉黃素順式異構體提取量逐漸增大。故選擇超聲功率150、180、210 W作為響應面實驗三水平。

圖5 不同因素對南瓜皮中反式葉黃素及其順式異構體提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on the trans lutein and its cis isomers extraction from pumpkin peel注:葉黃素順式異構體提取量為9-順式-葉黃素、9′-順式-葉黃素、13/13′-順式-葉黃素及15-順式-葉黃素提取量之總和。

2.3.3 液固比的影響 如圖5c,當液固比在20∶1～40∶1 (mL/g)范圍內,液固比對南瓜皮中反式葉黃素及葉黃素順式異構體提取量的影響一致,均呈先增加后減少的趨勢,當液固比為35∶1 mL/g時,反式葉黃素和葉黃素順式異構體分別達到最大值(194.3±14.9) μg/g dw和(13.8±1.6) μg/g dw。說明隨著溶劑用量的增大,物料與溶劑的接觸面濃度差增加、滲透壓增大,葉黃素更容易浸出[27]。當溶劑比例超過35∶1 mL/g,反式葉黃素及其順式異構體提取量逐漸下降,可能由于固液比增大,雜質提取量大。故選取液固比30∶1、35∶1、40∶1 mL/g作為響應面實驗三水平。

2.3.4 超聲時間的影響 由圖5d可見,隨著超聲時間的延長,南瓜皮反式中葉黃素提取量先增加后減少。說明在提取初期,葉黃素沒有充分溶出,隨著時間的延長,超聲波中的空化泡爆破時產生大的渦漩及在提取物表面產生的微射流都加速了葉黃素的擴散速率[28-29],在40 min達到最大值后,繼續(xù)延長超聲時間,反式葉黃素提取量開始下降,而葉黃素順式異構體提取量一直呈線性增加,這可能與長時間超聲產生熱量積聚導致反式葉黃素發(fā)生氧化降解有關[30],因此,選擇提取時間30、40、50 min作為響應面實驗三水平。

2.4響應面優(yōu)化實驗

2.4.1 模型的建立及顯著性檢驗 FCCD實驗設計與結果見表3,通過Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到回歸方程如下:

Y1=168.54+48.09x1-6.38x2+17.36x3+0.89x1x2-1.58x1x3-0.8x2x3+1.98x12-0.31x22+0.25x32Y2=9.63+3.51x1+1.60x2+0.11x3+0.53x1x2-0.73x1x3-0.83x2x3-0.59x12-0.26x22-1.24x32

對回歸模型進行方差分析(表4)可知,反式葉黃素提取量的回歸模型(p<0.0001)極為顯著,而失擬性檢驗不顯著(p=0.2118>0.05),說明所選用的二次回歸模型與實驗具有良好的擬合度。模型的決定系數(shù)R2=0.9977,說明該方程與實際情況相符,可以充分反映各因素與響應值的真實關系;由自變量F值大小可知,各因素對反式葉黃素提取量的影響由大到小依次為:超聲功率>液固比>提取時間,說明在超聲提取過程中影響反式葉黃素提取量的首要因素是超聲功率,這與前人[31]研究結果一致。也有學者認為[32],超聲時間對葉黃素提取效果影響最大,其次是液固比,超聲功率影響最小,這可能與提取原料特性有關。

從表4還可看出,葉黃素順式異構體提取量的回歸模型達到極顯著水平(p<0.0001),失擬項不顯著(p=0.4077>0.05),決定系數(shù)R2=0.9440,說明模型與實際的實驗擬合很好;由自變量的p值可知,模型的一次項x1、x2差異極顯著(p<0.0001),交互項x2x3顯著(p<0.05),其他項差異不顯著,這說明各影響因素對葉黃素順式異構體提取量的影響不是簡單的線性關系。由自變量F值大小可知,影響葉黃素順式異構體提取量的首要因素是超聲功率,其次是提取時間,液固比對其影響最小。

表3 響應面分析實驗設計及結果Table 3 Experimental design and results of response surface

注:葉黃素順式異構體提取量為9-順式-葉黃素、9′-順式-葉黃素、13/13′-順式-葉黃素及15-順式-葉黃素提取量之總和。

表4 回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 4 Significance of each coefficient in the fitted regression model

注:“*”為差異顯著(0.01

2.4.2 最佳工藝條件的驗證 利用Design Expert 軟件的優(yōu)化功能,在回歸模型的基礎上獲得的最佳工藝為:超聲功率209 W,提取時間30 min,液固比40∶1 mL/g,考慮到實際的可行性和便利性,修正提取工藝為:超聲功率210 W,提取時間30 min,液固比40∶1 mL/g,在此條件下反式葉黃素及其葉黃素順式異構體的提取量預測值分別為239.1 μg/g dw和9.1 μg/g dw。對此工藝進行三次平行驗證實驗,得到反式葉黃素的實際提取量為(229.7±9.1) μg/g dw,葉黃素順式異構體實際提取量為(9.4±0.2) μg/g dw,與優(yōu)化方案的理論值相比,相對誤差分別為3.9%和3.3%,說明模型可靠。

3 結論

本研究采用超聲波法提取南瓜皮中的葉黃素,確定了南瓜皮葉黃素提取的最佳溶劑為乙醇-石油醚(2∶1,V/V),南瓜皮葉黃素提取物中共鑒定出1種反式葉黃素和4種葉黃素順式異構體(9-順式葉黃素,9′-順式葉黃素,13/13′-順式葉黃素,15-順式-葉黃素)。在單因素實驗基礎上,通過中心組合實驗設計及響應面模型優(yōu)化,確定了超聲波法提取南瓜皮葉黃素的最佳工藝條件:乙醇/石油醚體積比2∶1、液固比40∶1 (mL/g)、超聲功率210 W、提取時間30 min,在此條件下反式葉黃素提取量為(229.7±9.1) μg/g dw,與優(yōu)化方案的理論值相近,模型可靠。

此外,研究結果表明,超聲功率對葉黃素提取量的影響較大,高功率超聲波能促進葉黃素溶出,但功率過大會導致反式葉黃素異構化;而長時間超聲產生熱量積聚也可能導致反式葉黃素發(fā)生氧化降解。

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