符東順， 何冠諦， 付天嶺， 何騰兵，3

(1.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025； 2.貴州大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州貴陽 550025； 3.貴州大學農(nóng)學院，貴州貴陽 550025)

重金屬污染是當今世界關注的焦點問題之一[1]，主要表現(xiàn)在重金屬對生物和環(huán)境的危害性上。一方面，重金屬被排入環(huán)境后具有永久性，且可在生物體內(nèi)慢慢累積[2]。另一方面，大部分重金屬并非生物體的必需元素，當重金屬元素含量達到某一生物的耐受水平時，過量重金屬可以對生物體的結構成分造成破壞，進而威脅生物生存。隨著人們對重金屬危害這一問題的進一步關注，重金屬污染土壤修復技術應運而生。傳統(tǒng)的重金屬修復手段本身有較大缺陷，如客土、覆土、鈍化劑等措施花費巨大但收效甚微，同時可能還會引入新的污染物造成更嚴重的危害[3]。生物修復技術因其材料廣、價格低、吸附能力強、易于管理等優(yōu)勢成為當前的主流修復技術[4]。目前生物修復技術以豆科植物根瘤菌協(xié)助植物抵御重金屬脅迫作為新的研究趨勢[5]。雖然新修復手段能克服傳統(tǒng)修復手段中的大部分弊端，但該研究尚處于初步階段。在種源方面，自然生長狀態(tài)下豆科植物的根瘤菌幾乎無協(xié)助植物體抵御重金屬吸收的能力或者效果很低，而基因技術獲得的高抗性豆科植物在實際中的應用效果并不明確；根瘤菌與植物的共同體是否有活化周圍環(huán)境中重金屬的能力也尚未明確；除植物體吸收的重金屬外，剩余的重金屬是否對人體和環(huán)境造成危害等許多新問題還沒得到很好解決。另外，以抗性植物(高累積和低吸收的生物)作為新的土地修復手段從20世紀50年代[6-7]后開始受到廣泛關注，隨著分子水平研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，植物體在重金重屬脅迫下不僅外在特征會發(fā)生改變，植物體內(nèi)的抗性基因也可通過表達轉(zhuǎn)錄蛋白來響應重金屬脅迫。這些植物體內(nèi)所表現(xiàn)的作用機制及其模型逐漸被探討并在品種選育以及食品安全和土地修復等領域被運用?？偠灾?，近些年抗重金屬的生物研究主要從抗性基因的篩選、耐抗基因/數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus，簡稱QTL)的定位、基因分離及表達、耐受性的遺傳模型分析等方面取得進展，因此本文主要從抗性材料的發(fā)現(xiàn)和基因獲取、基因定位的方法和技術、抗性基因的作用機制等方面進行論述。

1 抗性材料與篩選方法

植物抗性(plant resistance)是指植物適應逆境的能力?？剐圆牧系墨@取在闡釋整個生物抗性的研究中具有關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，生物普遍具有不同程度的抗重金屬脅迫能力，如微生物具有生命周期短、適應性強、突變頻率高等特點，是抗重金屬脅迫試驗的首選材料；動物生命周期長，抗性性狀不明顯，基因突變低，卻能穩(wěn)定遺傳，可用來進行特定的研究；植物只須觀察脅迫環(huán)境下的生存狀態(tài)就可以被辨認是否具有抗逆性，具有來源廣，穩(wěn)定遺傳，且可通過有性和無性生殖來適應不同環(huán)境等特點，因此成為科學研究中最常見的試驗材料[8]，當前用來研究耐重金屬脅迫的植物主要有紅景天[9]、蜈蚣草[10]、黑麥草[11]等以及經(jīng)濟作物水稻[12]、黑麥[13]等。就植物耐重金屬的能力而言，不同科屬植物所表現(xiàn)的能力不同，一般來說，木本植物抗重金屬脅迫的能力最好[14]。Mench等通過研究普通煙草(NicotiamatabacumL.)、黃花煙草(N.rustica)、玉米等3種植物對鎘(Cd)脅迫的響應表明，由于生理代謝差異，不同植物對鎘的耐受能力不同，其中煙草抗性比玉米強；同一物種由于個體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)的不同，其抗性也存在明顯差異，普通煙草(NicotiamatabacumL.)抗鎘能力比黃花煙草(N.rustica)強[15]。Mench等的研究也表明，這2種煙草耐鎘脅迫強度與重金屬活化能力呈正相關關系[16]，因此，可以在不同濃度梯度重金屬脅迫下，通過觀察不同植物和品種間的耐受情況來篩選抗性品種；也可以通過馴化來培養(yǎng)種源，增強其耐受上限；或者用物理、化學等手段(紫外突變，化學藥劑等)誘導生物體基因突變，對突變的材料進行選擇性培養(yǎng)，從而獲得目的材料。

2 抗性基因的挖掘手段

植物表達的抗性主要由基因調(diào)控，對抗性性狀的深入研究就是對抗性物種基因的研究。在抗性基因的研究中，植物遺傳物質(zhì)測序是必不可少的。有時為了獲取更多的抗性基因信息，在對基因測序的同時還伴隨著基因定位。

2.1 抗性基因定位

基因定位(mapping of genes)即利用分子標記和目的基因的關聯(lián)性來確定目的基因在染色體上的位置和片段的長度。DNA測定的主要內(nèi)容是基因測序，并利用遺傳分析進行基因定位。在DNA測序中，基因混合池和cDNA文庫等手段的利用能大大提高數(shù)據(jù)的精確度并降低基因定位的工作量，因此被廣泛應用。以集團分離分析法(bulked segregation analysis，簡稱BSA)對基因測序為例[17]，該方法的思路是在構建基因混合池后，將基因混合池中的基因打斷，構建cDNA文庫，通過遺傳分析進行基因定位，然后對候選基因進行再定位及測序。基因混合池是采用1對具有目標基因且表型差異的親本所產(chǎn)生的任何一種分離群體進行構建的。在利用基因混合池檢測2組之間的遺傳信息差異時，與該性狀無關的差異會被消除，這樣所研究性狀相應遺傳信息的差異就被凸現(xiàn)出來了，從而排除其他性狀的干擾。高等植物的DNA由外顯子和內(nèi)含子2部分構成，外顯子具有編碼蛋白質(zhì)的功能，內(nèi)含子目前被普遍認為可能與編碼區(qū)的表達量相關，但本身不具備編碼蛋白的能力。為降低基因測序費用，通常會采用mRNA反轉(zhuǎn)錄或者其他一些技術來構建不含內(nèi)含子的cDNA文庫，同源克隆是其中一種手段。同源克隆是在了解目的生物具有某一功能但其功能基因未知的情況下，尋找有該功能且親緣關系很近的另一物種，且該物種的功能基因已定位，通過引物設計擴增出該功能基因片段內(nèi)的1段保守編碼基因，以該保守基因為模板通過PCR進行cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends)，以獲取整個目的基因，從目的生物中擴增出同源序列(homologous sequences，簡稱RGA)[18-20]。雖然同源克隆技術的限制因素很多，但在抗病基因作用機制、物種間親緣度以及環(huán)境在植物進化中的影響度等研究中具有很大的潛力。隨著分子生物學的快速發(fā)展，借助生物信息學與數(shù)據(jù)庫的聯(lián)用，能在短時間內(nèi)大規(guī)模識別、鎖定同源物種中人們所需要的基因，并通過生物技術獲取大量的抗逆性RGA。將這些RGA和功能基因比對后，可預測出目的基因的序列、結構及其轉(zhuǎn)錄蛋白所參與的抗脅迫反應，保守區(qū)域基因頻率的變化也可作為物種間親緣關系遠近的依據(jù)，同時也能判斷不同環(huán)境脅迫對物種間的影響。

植物的抗性基因主要有水平抗性(數(shù)量性狀)和垂直抗性(質(zhì)量性狀)等2種類型[21]。前者的生物抗性性狀由多個微效基因累積控制，而后者則由單個主效基因控制。所以在對基因進行定位時，可先進行遺傳分析，判斷抗性表現(xiàn)型是由主效基因控制還是多個微效基因控制，進而從1對具有目標基因且表型差異的親本所產(chǎn)生后代基因型分離比例來推斷抗性類型。另外，還須通過等位性測定來驗證目的基因是否已被定位。完成基因測序的前期工作后，即可進行基因的粗定位，通過遺傳圖譜上的分子標記連鎖目的基因，從而找到目的基因在染色體上的位置。分子標記之所以能連鎖目的基因是因為基因和遺傳標記都位于染色體的基因座位上，每個座位都以1個DNA片段的形式存在，兩者屬于同源物質(zhì)。與其他基因片段相比，它是以個體間核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，可直接在DNA水平上檢測生物個體之間的差異，是生物個體在DNA水平上遺傳變異的直接反映[22]。此外分子標記有明顯分辨區(qū)域，在穩(wěn)定性、共顯性、多樣性和數(shù)量方面也具有明顯優(yōu)異性[23]，因此具有輔助基因定位的作用。同樣在基因定位中，遺傳圖譜也是必不可少的工具。遺傳圖譜是某一物種的染色體圖譜，功能是顯示所知基因或遺傳標記的相對位置，可由遺傳重組測驗結果推算出在1條染色體上可以發(fā)生的突變位點的直線排列(基因位點的排列)圖[24]。為提高遺傳圖譜的分辨率和精度，須對作圖群體的選擇進行嚴格要求：親本間的相對性狀要表現(xiàn)出明顯差異；親本要有較高的單核苷酸多態(tài)性，以便尋找與要定位基因緊密連鎖的分子標記；試驗材料的種群數(shù)量應該滿足試驗要求，試驗材料的相對性狀分離要符合孟德爾分離定律；目的基因的基因型由其表現(xiàn)型表達，因此對表現(xiàn)型進行測定也是決定基因定位質(zhì)量的關鍵。通過嚴格篩選出來的分離群體可用來構建遺傳圖譜。遺傳連鎖圖譜的構建須依靠繪圖軟件(MapMarker、JionMap等)進行標記和表型統(tǒng)計，分析分子標記和基因控制的表現(xiàn)型的連鎖關系，參照連鎖圖譜構建的理論基礎(染色體的交換與重組)，1%的重組率近似于1 cM遺傳圖距，把已定位的基因片段按連鎖關系繪制在軟件上。用分子標記作遺傳圖譜會產(chǎn)生不同的帶型，因此只須找到和基因控制的表現(xiàn)型有連鎖關系的分子標記在遺傳圖譜產(chǎn)生的特定帶型便能完成主效基因的初定位。性狀是由基因和環(huán)境共同決定的，微效基因的每個基因只能產(chǎn)生部分影響效果，其性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異。相對主效基因而言，數(shù)量性狀的表現(xiàn)型由環(huán)境條件引起的變異概率更大。所以在分析數(shù)量性狀的表現(xiàn)型值中，通常先對環(huán)境影響進行評估，再算出基因所占的比率，進而評估數(shù)量性狀遺傳力的大小。永久性作圖群體、高世代回交QTL分析[25]、次級作圖群體[26]等在QTL分析中的應用，能把復雜性狀變?yōu)楹唵涡誀?，把多基因分解為符合孟德爾分離定律的單基因。永久性作圖群體在對QTL進行分析時具有以下優(yōu)勢：以各個品系作為分離單元，使得數(shù)量性狀的測量更加精準；易于進行重復試驗，以減少試驗誤差；可通過多點測試來評價基因與環(huán)境的互作關系。高世代回交QTL分析(advanced backcross QTL，簡稱AB-QTL)是用回交2代(BC2)或回交3代(BC3)進行微效基因定位的分析方法之一，該方法能很好地從野生型等非優(yōu)良材料中篩選優(yōu)良的QTL，為優(yōu)良品系的育種服務。AB-QTL分析的優(yōu)點：在低世代遠源雜交的群體中，通常會出現(xiàn)一些不良的性狀(如落花、落果等)影響數(shù)量性狀的測量。相對于低世代群體(F2、BC1等)，在AB群體的發(fā)展過程中，逐步淘汰一些來自供體的不良性狀；在高代回交群體中，個體表現(xiàn)型與優(yōu)良的輪回親本更加相似，AB群體的數(shù)量性狀表現(xiàn)更加正常，從而提高優(yōu)異數(shù)量性狀的測定；AB群體中供體的基因頻率很小，因此供體基因型之間的相互作用(上位性作用)基本可以消除，所以供體中的QTL轉(zhuǎn)移到受體后，其效應值變化不大；隨著回交次數(shù)的不斷增加，越容易地獲得近等基因系和進行重復的田間試驗。由于多次回交可使優(yōu)良性狀基因在減數(shù)分裂過程中的重組概率更大，容易打破QTL與不良基因之間的連鎖關系，因此可更好地進行QTL分析。次級作圖群體由近等基因系(near-isogenic line，簡稱NIL)、導入系(introgression line，簡稱IL)、染色體片段代換系(chromosomal segment subsititution line，簡稱CSSL)等次級品系發(fā)展而來。次級作圖群體在QTL分析中之所以能得到廣泛利用是因為它具有明顯的優(yōu)勢：首先次級作圖群體具有永久性群體的特點，能夠被反復使用，且能排除環(huán)境的影響；其次每個品系與輪回親本的遺傳背景十分相似，所以無遺傳背景的干擾，因此QTL表型分析的結果較準確；最后各個品系只含有供體親本很小部分的遺傳物質(zhì)，通常只含有1個或少數(shù)幾個基因片段，所以能把控制同一數(shù)量性狀的多個QTL進行分解，即把多基因分解為符合孟德爾定律的單一因子，使復雜性狀簡單化，從而大大提高QTL分析的準確度和可靠性?？傊虼侄ㄎ痪褪峭ㄟ^找出與目的基因有關聯(lián)的分子標記來確定基因在染色體上的位置，而精細定位則是利用更小的標記分子大幅度縮小候選基因的范圍。

2.2 基因測序

基因定位對研究植物的抗性是遠遠不夠的，植物響應重金屬脅迫一般是以基因為主導的行為變化，通過功能基因的堿基序列編碼蛋白來調(diào)節(jié)植物生理，從而適應環(huán)境脅迫，因此還須了解已定位基因的堿基序列。從1977年第一代DNA測序技術(Sanger法)應用至今，短短幾十年內(nèi)，基因測試技術已發(fā)展到第三代。Sanger雙脫氧鏈終止法原理是在新合成的DNA鏈中加入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)這種特殊核苷酸底物后，由于在脫氧核糖的3′位置缺少1個羥基，不能形成磷酸二酯鍵，從而無法與其他正常核苷酸連接[27]；將此片段和其他參與DNA合成的材料一起保溫，可形成許多以雙脫氧核苷酸ddx(dd表示雙脫氧，x表示A，C，G，T)殘基為3′端結尾的基因片段，再將這些基因片段平行地點加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上，通過跑膠進行分離，從而得到相應的放射性自顯影圖譜，進而確定x的信息。但一代測序的定位時間長、價格高、低通量等特點導致其無法大規(guī)模地流行，二代測序由于具有高通量的特點，因此目前依然占有很大的市場。目前的二代測序平臺主要有基于焦磷酸測序原理的454(GS-FLX)，以DNA簇和可逆性末端終止為核心技術的Solexa-Illumina Genome Analyzer[28]，基于雙堿基編碼原理的SOLiD[29]和以連接反應進行DNA序列分析的Polonator[30]。但二代測序技術存在讀取長度短、樣品制作難等缺陷。三代測序是一種納米單孔測序技術，其測序過程無須進行基因的擴增。其中PacBio SMRT技術[31]采用邊合成邊測序的策略，以SMRT芯片為測序載體，使DNA聚合酶和模板結合4色熒光標記的4種堿基，在堿基配對階段，隨著不同堿基的加入所產(chǎn)生的不同光就會被捕獲，這樣就能依據(jù)光的波長和峰值來判定進入的堿基種類。三代測序相對于二代測序來說，準確度偏低，但所產(chǎn)生的誤差都是隨機誤差，可以通過多次試驗進行消除，還能利用零模波導孔(zero mode waveguide hole，簡稱ZMW)消除孔外過多的游離核苷酸單體產(chǎn)生的熒光，從而降低背景值；也可通過相連2個堿基的測序時間來檢測一些基因的修飾情況，避免傳統(tǒng)測序手段中對甲基化基因組進行的重亞硫酸鹽(bisulfite)處理。DNA定位和測序完成后即可得出目的基因的位置和堿基序列，通過基因比對找到突變基因，QTL定位還須對每個基因的貢獻度進行評估。相對而言，表達水平的抗性基因研究省去了基因定位環(huán)節(jié)，只須提取某種細胞在特定生理條件下產(chǎn)生的mRNA并直接對其進行測序，再用Q-PCR驗證差異表達基因，也可以采用RNA干擾(RNA interference，簡稱RNAi)干擾技術啟動正向驗證，或者通過過表達目標基因進行功能驗證，基因驗證后即可得到目的基因的全部信息或者基因序列的信息，同時也可獲得該基因所轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)信息，進而根據(jù)表達蛋白質(zhì)的類型和所涉及的功能等來闡述基因的作用機制。

3 植物抵抗重金屬的作用機制

重金屬對植物的毒害是由重金屬的吸收位點、植物細胞中對重金屬結合位點的競爭、重金屬離子的特性和有效性以及各種化學作用等一系列因素決定的[32]。重金屬脅迫對生物的作用是相對的，一方面重金屬脅迫對植物水分代謝、光合作用、呼吸作用、碳水化合物代謝、氮素代謝、核酸代謝產(chǎn)生直接傷害，另一方面為適應不良的生存環(huán)境，植物已建立起一系列以基因表達為主導的生理機制，通過多種離子通道運輸轉(zhuǎn)錄蛋白參與自身生理活動，使植物作出一系列調(diào)整(滲透調(diào)節(jié)、脫水保護、抗氧化防御)來響應重金屬的脅迫，從而更好地適應逆境[33]。重金屬脅迫首先被各種受體感知，這種感知通常以滲透脅迫的形式傳遞到細胞受體，再通過各種信使傳導引起胞內(nèi)網(wǎng)絡級聯(lián)反應的響應，以避免或者減輕重金屬脅迫的危害。在脅迫應答過程中，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起關鍵性作用。

3.1 植物外部在重金屬脅迫下的變化

植物體可通過改變自身的形態(tài)結構來更好地適應重金屬脅迫環(huán)境。葉和根既是主要吸收重金屬的器官又是抵御多余重金屬毒害的第一道防線。部分植物的葉片絨毛有利于抵御空氣中重金屬離子進入氣孔，且在低濃度的重金屬環(huán)境中，重金屬主要富集在新葉，但在高濃度的環(huán)境中，重金屬能從新葉遷移到老葉并以脫落的形式達到降低體內(nèi)重金屬含量的目的[34]；而根際表面的多糖黏液與Cd、鋁(Al)等重金屬有很強的親和性，能把重金屬阻止在根部外；同時，在重金屬的誘導下，根部產(chǎn)生有機酸，這些有機酸可通過改變土壤的理化性質(zhì)形成根際效應來減少根部對重金屬的吸收。通過Al刺激不同品種小麥發(fā)現(xiàn)，有機酸先從小麥根尖陰離子通道[35-37]釋放出去，這些不同基因型的小麥產(chǎn)生的有機酸含量與該品種抗重金屬的能力成正比[38-41]，往Al敏感品種中加入有機物酸(蘋果酸鹽、檸檬酸鹽或草酸鹽)能提高敏感品種抗Al的能力[42]。這種情況在Mench等的研究中也有大量體現(xiàn)[15]，他們還計算出了Cd與分泌物絡合的穩(wěn)定常數(shù)和最大吸附量呈正相關關系，表明Cd可與根分泌物形成配位化合物，且這些化合物不會被運往膜內(nèi)或被根吸收[43-44]；研究還發(fā)現(xiàn)，有機酸陰離子的釋放與植物體受到重金屬脅迫的時間一致[45]，在受Al脅迫后的幾個小時內(nèi)，參與合成有機酸的關鍵酶(PEP羧化酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶)一直處于活躍狀態(tài)；同時還發(fā)現(xiàn)，在Al脅迫下小麥根尖組織外排的有機酸和基因有關，將細菌內(nèi)合成檸檬酸的基因轉(zhuǎn)錄到馬鈴薯中，能促進檸檬酸的合成并明顯提高馬鈴薯的抗性。植物體除了通過老葉外排重金屬來減輕重金屬危害外，通過研究植株各個部分的重金屬富集情況發(fā)現(xiàn)，植物體還可通過將大部分重金屬集中在地下部分，有效防止重金屬遷移到地上部分，從而減輕地上部分受到的傷害。這種植物體不吸收環(huán)境中高含量的重金屬從而免受毒害的現(xiàn)象被稱為避性。在這種避性作用下，植物體內(nèi)的重金屬濃度并不高，且能維持自身在重金屬污染環(huán)境中較正常的生長。

3.2 植物體內(nèi)細胞在重金屬脅迫下的變化

3.2.1 細胞壁在重金屬脅迫下的變化 細胞壁是由多糖(纖維素和果膠)、蛋白質(zhì)和脂類等組成的網(wǎng)狀結構；其中多糖含有羥基、羧基和磷酸根等各種離子基團和一定的負電荷，這些結構決定了細胞壁具有吸附多種重金屬的能力。研究表明，處理后的鎘作用于某些植物后，部分植物的細胞壁上含有大量可溶性鎘[46]，另外密毛厥細胞壁能固定70%～90%的銅、鋅、鎘，通過顯微鏡能觀察到外部的重金屬含量高于細胞內(nèi)部，但不是所有植物都能出現(xiàn)這種現(xiàn)象[47]。重金屬要進入細胞內(nèi)必須先通過根尖細胞的細胞壁，且通過胞外途徑和胞內(nèi)途徑運往細胞內(nèi)時至少還須再經(jīng)過1層細胞壁，所以細胞壁可以作為阻擋重金屬進入植物體的第一道屏障。

3.2.2 質(zhì)膜在重金屬脅迫下的變化 細胞膜是最重要的分隔細胞內(nèi)和細胞外不同介質(zhì)和組分的界面，同時是重金屬脅迫信號的接收器，也是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關鍵。當重金屬與細胞壁的結合達到飽和時，就必須經(jīng)過跨膜運輸運往原生質(zhì)體，此時部分重金屬會與磷脂雙分子層上的離子絡合，如膜上Ca2+能與砷結合形成砷酸鹽和亞砷酸鹽沉淀。在非生物脅迫下，信號先被膜受體感知，再被跨膜蛋白上的酶聯(lián)反應放大，通過轉(zhuǎn)錄因子激活下游功能基因的表達從而轉(zhuǎn)錄成各種調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白質(zhì)可通過各種離子通道進行轉(zhuǎn)運，以調(diào)節(jié)重金屬外排和絡合重金屬等方式來減少植物體內(nèi)重金屬有效態(tài)。最具有代表性的是脫落酸(abscisic acid，簡稱ABA)的合成，ABA是一種重要的參與逆境響應的植物激素[48]。當細胞膜上的受體感應到重金屬脅迫信息時，ABA合成酶的相關基因會被激活，通過各種細胞器合成ABA。ABA可誘導、活化大部分功能基因啟動子，從而誘導抗重金屬基因的表達，因此1個功能蛋白的被轉(zhuǎn)錄可能是多個基因相互表達的結果。如玉米的ZmUBP基因與Cd2+的脅迫響應有關[49]。泛素特異蛋白酶(ubiquitin-specific protease，簡稱VSP)[50]存在于真核生物中，經(jīng)組織表達模式分析發(fā)現(xiàn)，檉柳的ZmVBP和ZmVBPa/b/c基因可響應脫落酸與重金屬脅迫，在ABA脅迫下這些基因的轉(zhuǎn)錄蛋白活躍表達，通過轉(zhuǎn)基因技術將這些基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，可提高擬南芥對ABA的敏感性和重金屬的抗性，研究還發(fā)現(xiàn)，ZmVBP16a基因的過量表達可引起3個抗氧化功能基因表達量的上調(diào)，經(jīng)過雙分子熒光互補技術(bimolecular fluorescence complementation，簡稱BiFc)分析得出，Zmtcp15b和Zmtcp15a在植物體內(nèi)外相互作用，因此Zmvbp14與Zmtcp15家族蛋白可能在逆境響應上具有協(xié)同作用，同樣運用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術也驗證檉柳能響應Zn2+、Cd2+、Cu4+的脅迫[50]。受到脅迫時，檉柳Lea基因過量表達會引起植物內(nèi)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)、過氧化物酶(peroxisome，簡稱POD)活性上升，脯氨酸含量以及可溶性蛋白的增加，丙二醛(malonaldehyde，簡稱MDA)減少，說明Lea基因能輔助其他抗重金屬功能基因的表達，但是Lea本身有順式反應元件，所轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)有穩(wěn)定細胞膜、作為分子屏障、與重金屬離子結合和防止細胞氧化等功能，有些像檉柳Les基因一樣，本身就具有抗重金屬的能力，這部分基因的5′非翻譯區(qū)通常含有與重金屬脅迫相關的順式原件，從而直接響應重金屬的脅迫[50]。如重金屬進入細胞內(nèi)能產(chǎn)生活性氧自由基，使細胞內(nèi)的生物大分子受到損傷，而植物體內(nèi)的SOD、POD、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，簡稱GSH)等抗氧化物能夠消除部分重金屬侵害植物時隨之產(chǎn)生自由基過多的問題[51]。擬南芥中編碼谷胱甘肽合成酶的ATGC、ATGCS基因能直接響應重金屬脅迫，進而催化產(chǎn)生GSH和植物螯合肽(phytochelatin，簡稱PC)，這些物質(zhì)能與被吸收的重金屬通過沉淀、絡合、吸附等形成無毒穩(wěn)定的化合物并固定在相對無害的區(qū)域[52]。同樣，紫花苜蓿的AtATM3基因(編碼色素氧化酶)能與ATP結合盒轉(zhuǎn)運b基因來增強GSH和PC的合成來響應重金屬脅迫[53]。細胞除了能消除重金屬脅迫帶來的細胞氧化、絡合作用以及無毒區(qū)域固定化的功能外，還具有外排重金屬的功能。在耐鋁品種的研究中，在小麥細胞外液pH值為4.0～4.5，細胞質(zhì)內(nèi)pH值為7.0的體系中，鋁離子通過質(zhì)外體運至細胞質(zhì)后能和蘋果酸、檸檬酸結合，形成的絡合物再通過細胞膜上的通道運出[13]。總而言之，植物體消除重金屬脅迫主要依賴外排、內(nèi)解作用。

4 總結

植物抗性的研究起步早，各種基因定位方法和作用機制隨著時間推移形成了從淺到深，從點到面的發(fā)展體系。現(xiàn)有的抗性基因研究已能夠全面深入地闡釋植物體如何通過基因轉(zhuǎn)錄的蛋白調(diào)控自身生理活動，如何通過編碼特殊的組織蛋白響應重金屬毒害，以適應逆境。這些理論同時也揭示了不同植物體之間由于基因上的差異導致的結構和生理上的差異，致使植物體呈現(xiàn)不同抗重金屬的能力，這為抗性品種的選育和環(huán)境的重金屬污染治理提供一定的理論和技術支撐。然而現(xiàn)有技術的不完善和使用上的受限加之大部分的抗逆性能力是由多種微效基因加持而來，很少由主效基因直接控制，使得抗性基因和抗性植物在土地修復中難以運用。目前研究的主要障礙有2個方面：(1)抗性植物在修復重金屬污染的過程中，部分已被植物體吸收的重金屬又會以殘枝落葉的形式回歸土壤，而回收植物體生長各個時期的枯枝落葉消費巨大，回收后的物質(zhì)也難資源化；自然界中以重金屬為植物生理代謝所需元素的品種較少，即使找到該品種，在修復污染土壤的問題上，它只作為轉(zhuǎn)換重金屬價態(tài)的介質(zhì)，植物體從土壤中吸收的重金屬同樣面臨著資源化的問題?？傮w而言，不管抗性基因還是抗性品種都存在資源大卻難以利用的局面，但是隨著科技的發(fā)展，相信新的技術能把植物體吸收和外排重金屬的特性和化學純化重金屬原理結合，從而資源化這些放錯位的重金屬資源。例如，是否可以利用離子通道載體蛋白吸收特定的重金屬，使其以一種螯合物的形式富集起來，再結合化學中的可逆反應，通過改變反應條件使重金屬與載體蛋白分離，從而使重金屬純化。(2)基因測序和轉(zhuǎn)錄組測序同是研究抗性性狀的一種手段，但兩者的側重點不同，基因測序大部分通過檢察目的基因編碼區(qū)域突變位點來闡述作用機制，而轉(zhuǎn)錄組測序則關注于某種脅迫下全部cDNA的表達。2種技術就像按源頭和按過程處理問題一樣，相輔相成。轉(zhuǎn)錄組作為一種過程來研究抗性基因，結果應該以一種動態(tài)的、連續(xù)的狀態(tài)進行表現(xiàn)，而不是以點的形式表達。這樣就能避免在非生物脅迫下，一部分抗性基因由于點式的測樣而未能被記錄。筆者認為，轉(zhuǎn)錄組測序過程中動態(tài)檢測最難的是不斷往測序系統(tǒng)中輸入RNA，在測序系統(tǒng)前添加多個自動、獨立、高效提取RNA的提取器或許能解決這一問題。這樣構建系統(tǒng)測得的結果就能以動態(tài)譜線的形式呈現(xiàn)出來。

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