劉蕾 李硯 郭元彪

[摘要] 目的 研究SALL4在胃癌患者與健康人群血清中含量差異，并探討SALL4分子在胃癌進展中的作用。 方法 選擇2016年3月～2018年4月在成都市第三人民醫(yī)院治療的47例胃癌患者和參加體檢的29例健康志愿者。采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測血清中SALL4含量；采用Real-time PCR和Western blot分析SALL4在多種胃癌細胞株和胃黏膜細胞株中的mRNA水平和蛋白水平表達情況；通過siRNA干擾研究SALL4對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響；Western blot分析上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子表達情況。 結(jié)果 SALL4在胃癌患者血清中的含量顯著高于健康志愿者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.0001）。SALL4在多種胃癌細胞株中mRNA水平和蛋白水平的表達情況均高于胃黏膜細胞株。干擾SALL4表達后，胃癌細胞的遷移能力和侵襲能力均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。SALL4表達降低可導(dǎo)致E-cadherin表達上調(diào)，snail、β-catenin和Wnt3a表達下調(diào)。 結(jié)論 SALL4與胃癌進展相關(guān)，可能通過誘導(dǎo)胃癌細胞EMT進程，促進細胞遷移和侵襲。

[關(guān)鍵詞] SALL4；胃癌；細胞遷移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

[中圖分類號] R735.2；R73-37 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the difference of serum SALL4 levels between gastric cancer patients and healthy people， and to explore the role of SALL4 in the progression of gastric cancer. Methods A total of 47 patients with gastric cancer who were treated in the Third People′s Hospital of Chengdu from March 2016 to April 2018 and 29 healthy volunteers who participated in the physical examination were selected. The serum levels of SALL4 were detected by ELISA. The expression of SALL4 in mRNA level and protein level in various gastric cancer cell lines and gastric mucosa cells were analyzed by Real-time PCR and Western blot respectively. The effects of SALL4 on the cell migration and invasion ability were analyzed by siRNA interference. The expression levels of related molecules of epithelial-mesenchymal transition （EMT） were detected by Western blot. Results The serum SALL4 levels in patients with gastric cancer were significantly higher than those in healthy volunteers， and the difference was highly statistically significant （P < 0.0001）. The expression of SALL4 mRNA and protein in various gastric cancer cell lines was higher than that in gastric mucosal cell lines. The migration and invasion ability of gastric cancer cells were significantly decreased after interfering SALL4 expression， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Decreased expression of SALL4 leaded to the up-regulation of E-cadherin expression and the down-regulation of snail， β-catenin and Wnt3a. Conclusion SALL4 is related to the progression of gastric cancer. It may promote cell migration and invasion by inducing the EMT process in gastric cancer cells.

[Key words] SALL4； Gastric cancer； Cell migration； Epithelial-mesenchymal transition

胃癌是全球最常見的四大惡性腫瘤之一，超過50%的病例發(fā)生在亞洲東部。在亞洲，胃癌是繼乳腺癌和肺癌后最常見的第三大惡性腫瘤，是繼肺癌后第二常見的癌癥死亡原因[1]。雖然近年來腫瘤綜合治療技術(shù)快速發(fā)展，但胃癌患者整體臨床療效并沒有顯著改善。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是胃癌預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)[2]。探索胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制有望為胃癌臨床治療提供新的思路。人類婆羅雙樹樣基因-4（sal-like protein 4，SALL4）是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，位于人類20號染色體q13，有4個外顯子[3]。SALL4不僅在早期胚胎發(fā)育、維持胚胎干細胞多能性和自我更新方面發(fā)揮著重要的作用，而且與遺傳性疾病、血液系統(tǒng)腫瘤、生殖細胞腫瘤等多種惡性腫瘤密切相關(guān)[4]。本研究通過檢測SALL4在健康人群和胃癌患者血清中的水平，分析SALL4對胃癌細胞遷移能力的影響及相關(guān)分子機制，探索SALL4分子在胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月～2018年4月在成都市第三人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）治療的47例胃癌患者，其中男35例，女12例；年齡28～81歲，平均（57.47±9.77）歲。選取同期在我院接受體檢的29例健康志愿者作為對照，其中男18例，女11例；年齡24～71歲，平均（55.37±11.72）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：采取胃鏡和病理檢查進行確診為胃癌。納人標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診；②進行本研究前未接受放化療等相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型腫瘤者；②有嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病、感染性疾病、心力衰竭、腫瘤病史以及重大手術(shù)史者；③就診前服用過消炎、鎮(zhèn)痛等藥物者；④合并心、肝、腎等原發(fā)性疾病者；⑤臨床資料不全者。胃癌患者與健康體檢者的性別、年齡等基礎(chǔ)資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

Trizol試劑購于Invitrogen公司（貨號：15596026），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司（貨號：RR047A），實時熒光定量PCR（Real-time PCR）試劑盒購于TaKaRa公司（貨號：RR820A），蛋白裂解液RIPA購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號：P0013C），BCA法蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo Scientific公司（貨號：23227），一抗SALL4和Wnt3a購于abcam公司（貨號：ab29112、ab28472），E-cadherin、snail、β-catenin和GAPDH購于CST公司（貨號：3195、3879、8480和97166），電子學(xué)元件實驗室（ECL）化學(xué)發(fā)光液購于Millipore公司（貨號：WBKLS0100），細胞轉(zhuǎn)染試劑購于QIAGEN公司（貨號：301705）。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

采用PerkinElmer公司全自動酶標(biāo)儀，按照SALL4酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（Mybiosource公司，貨號：MBS914458）說明書進行檢測。

1.4 Real-time PCR

用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Roche公司定量PCR儀，采用SYBR Green法進行qPCR分析。以GADPH基因為內(nèi)參，2-△△Ct法計算SALL4基因的相對表達量。SALL4基因上游引物序列：5′-TTTTACCACCAAAGGCAACT-3′，下游引物序列：5′-CACAACAGGGTCCACATTC-3′；GADPH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.5 免疫印跡（Western blot）

用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。80 V轉(zhuǎn)膜3 h，脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃孵育相應(yīng)的一抗過夜。洗滌緩沖液（TBST）清洗后加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h；TBST清洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，暗室中顯影。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，用siRNA-SALL4（sense：5′-GCUAGACACAUCCAAGAAATT-3′，anti-sense：5′-UUUCUUGGAUGUGUCUAGCTT-3′）及陰性對照siRNA-NC（sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，anti-sense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）轉(zhuǎn)染胃癌細胞系A(chǔ)GS，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測，驗證SALL4基因的干擾效率，用于后續(xù)實驗。

1.7 細胞遷移和侵襲實驗

采用劃痕實驗評估細胞的遷移能力。將轉(zhuǎn)染siRNA-SALL4和siRNA-NC的細胞分別接種于6孔板中，待細胞鋪滿培養(yǎng)板后，用200 μL槍頭垂直畫線，PBS清洗3次，加入含有2%血清的培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后再次拍照。測量兩組細胞劃痕寬度并計算相對遷移率。

采用Transwell實驗評估胃癌細胞的侵襲能力。將轉(zhuǎn)染siRNA-SALL4和siRNA-NC（對照組）的細胞分別重懸于無血清培養(yǎng)基中，置于含有Matrigel的上室內(nèi)，在下室中加入含有30%血清的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦拭掉上室細胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，置于顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者及健康志愿者血清中SALL4的含量

ELISA檢測結(jié)果顯示，胃癌患者血清中SALL4的濃度為（286.55±31.28）pg/mL，對照血清中SALL4的濃度為（28.36±3.46）pg/mL，胃癌患者血清中SALL4的含量顯著高于健康志愿者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.0001）。見圖1。

2.2 胃癌細胞中SALL4表達情況

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與胃黏膜細胞株GES-1比較，SALL4分子在胃癌細胞株AGS中的mRNA水平顯著升高（P = 0.0472），在胃癌細胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901中的mRNA水平也呈增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。Western blot檢測結(jié)果也顯示SALL4分子在上述胃癌細胞株中的蛋白表達水平高于胃黏膜細胞株。見圖2。

2.3 siRNA對胃癌細胞中SALL4的干擾情況

胃癌細胞AGS中分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-SALL4，Real-time PCR檢測干擾效率。結(jié)果顯示，AGS-siSALL4細胞中SALL4的mRNA水平顯著低于siRNA-NC（P = 0.0401）；Western blot驗證蛋白水平的干擾效率也獲得一致的結(jié)果，提示可以用于后續(xù)實驗。見圖3。

2.4 SALL4對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，干擾SALL4表達可顯著降低胃癌細胞的相對遷移率（P = 0.0367）。Transwell實驗結(jié)果顯示，SALL4表達降低導(dǎo)致胃癌細胞侵襲能力顯著降低（P = 0.0463）。提示SALL4可促進胃癌細胞遷移和侵襲能力。見圖4。

2.5 SALL4促進胃癌細胞遷移和侵襲的分子機制

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，SALL4表達下調(diào)可影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程相關(guān)分子的表達水平，即E-cadherin表達上調(diào)，snail、β-catenin和Wnt3a表達下調(diào)。提示SALL4可能通過誘導(dǎo)胃癌細胞EMT進程促進細胞遷移和侵襲。見圖5。

3 討論

癌細胞與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）有許多相似之處。ESCs基因在大多數(shù)成熟的組織器官中表達缺失，這些基因可能是癌癥特異性診斷和治療的理想候選靶點。SALL4是能夠建立ESCs與癌細胞相互聯(lián)系的少數(shù)基因之一[5]。胚胎發(fā)育早期，SALL4在維持ESCs的多能性和自我更新方面起著至關(guān)重要的作用[6-7]；出生后，隨著組織器官成熟，SALL4表達逐漸降低。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，SALL4在多種惡性腫瘤中被重新表達。

SALL4表達情況和表觀遺傳狀態(tài)的分析表明，SALL4在多種腫瘤中異常表達，如肺癌[8]、乳腺癌[9-10]、子宮內(nèi)膜癌[11-12]、結(jié)腸癌[13]、胃癌[14-16]、肝細胞癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]等。上述研究提示，SALL4可以作為腫瘤診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。然而，這些研究部分關(guān)注SALL4的RNA表達水平，部分關(guān)注蛋白質(zhì)表達水平。即使是對于SALL4蛋白免疫組化的研究，也因使用不同的抗體而產(chǎn)生不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，將SALL4發(fā)展為腫瘤診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物還面臨較大挑戰(zhàn)。本研究采用ELISA檢測胃癌患者血清中SALL4分子的濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中SALL4的表達顯著高于健康志愿者。這為將SALL4開發(fā)成血清腫瘤標(biāo)志物提供了依據(jù)。

SALL4分子在癌癥的發(fā)生和進展過程中起著多方面的作用，如調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移、化療抵抗和維持腫瘤干細胞特性等。進一步探索SALL4致癌作用的潛在分子機制有望將其開發(fā)為新的癌癥治療靶點。研究者發(fā)現(xiàn)，SALL4在多種腫瘤中異常表達與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SALL4表達下調(diào)顯著抑制了子宮內(nèi)膜癌中癌細胞的體外遷移和侵襲特性以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移潛能，這與SALL4特異性結(jié)合子宮內(nèi)膜癌細胞中c-Myc基因啟動子區(qū)相關(guān)[12]。SALL4表達與結(jié)直腸癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期呈正相關(guān)，其促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用可能與β-catenin的相互作用有關(guān)[19]。SALL4抑制基底樣乳腺癌中細胞間相互作用，導(dǎo)致細胞分散表型，促進腫瘤轉(zhuǎn)移，其可能的機制是SALL4對EMT因子ZEB1具有正向調(diào)節(jié)作用，從而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞的分散和間充質(zhì)基因的表達[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，SALL4在多種胃癌細胞株中的表達均高于與胃黏膜細胞株；在高表達SALL4的AGS細胞中干擾其表達，可以顯著降低胃癌細胞體外遷移和侵襲能力，相關(guān)分子機制可能是SALL4表達下調(diào)抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路活性，從而抑制胃癌細胞EMT進程。

綜上所述，本研究首次研究了SALL4分子在胃癌患者血清中的含量，為將SALL4開發(fā)成血清胃癌標(biāo)志物提供了依據(jù)。細胞水平研究結(jié)果提示，SALL4促進胃癌細胞遷移和侵襲能力可能與激活Wnt/β-catenin信號通路并促進EMT進程相關(guān)，這為胃癌提供了新的治療靶點。然而，其具體的分子機制需要進一步探索與證實。

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（收稿日期：2018-06-22 本文編輯：任 念）