馮韶華 曹洪戰(zhàn)蘆春蓮

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000）

2002年，Okazaki等[1]在對小鼠測序過程中最早發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）。最初，研究者認為lncRNA是非編碼RNA，不具有任何作用，僅僅是轉(zhuǎn)錄中的副產(chǎn)物，沒有生物學(xué)功能。而后隨著大量lncRNA被發(fā)現(xiàn)，人們逐漸改變了對lncRNA的認識，它不僅在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后參與各基因組的轉(zhuǎn)錄活動，還影響一些蛋白質(zhì)的編碼活動。因此，當(dāng)前對lncRNA的研究進入了火熱的階段。

1 lncRNA簡述

具有調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA分為lncRNA和短鏈非編碼RNA，lncRNA的核酸長度大于200 nt。哺乳動物中50%的DNA能轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA中僅有1%～2%能夠被轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)編碼RNA，其余的則會被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，因此研究非編碼RNA的功能和機制有助于加快動物或植物的遺傳進展。根據(jù)lncRNA在基因組中與蛋白質(zhì)編碼基因的相對位置，將其分為5類：正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA[2]。lncRNA是一類功能性RNA分子，位于細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)，以RNA形式在多種層面（如表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達水平[3]。自lncRNA被發(fā)現(xiàn)以來，其研究熱度一直在持續(xù)。

2 lncRNA的研究方法

目前，lncRNA的研究方法已逐漸成熟，研究者不斷探索新的方法對lncRNA進行深入研究，尤其在人類疾病研究中取得了較大的進展，當(dāng)前已建立了許多相關(guān)的lncRNA數(shù)據(jù)庫。篩選lncRNA的研究方法主要有2種：⑴高通量測序，通過測序不僅能夠獲得lncRNA，也會獲得其他轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，高通量測序最有可能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；⑵lncRNA芯片，目前芯片檢測主要用于人類疾病相關(guān)lncRNA的初篩。對lncRNA功能的研究方法主要有4種：⑴RNA干擾（RNA interference,RNAi），通過在細胞中特異性敲除相關(guān)lncRNA來檢測其功能作用，當(dāng)lncRNA定位于細胞質(zhì)時可采用此方法；⑵熒光定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR），它可以檢測低拷貝數(shù)的RNA，具有較高的靈敏性；⑶實時熒光定量PCR（RT-qPCR），一般又可分為2類，一類為染料類，一類為探針類；⑷熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization），其優(yōu)點是安全且靈敏度高。此外，對lncRNA機制的研究方法有RNA免疫沉淀技術(shù)（RNA immunoprecipi-tation,RIP），此方法可以研究與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的功能作用。

研究lncRNA的主要步驟分3步：⑴高通量測序以分析差異表達的lncRNA，基于RNA-seq技術(shù)對不同的動物組織進行測序，通過對結(jié)果的分析檢驗是否存在差異表達的lncRNA；⑵驗證測序結(jié)果并進行定位，測序后的結(jié)果可以通過相關(guān)網(wǎng)站比對，例如NONCODE等，確定所測序的基因序列及其所在位置；⑶確定功能，最后對lncRNA進一步研究，可通過建立lncRNA表達載體或沉默lncRNA的方法進行功能分析。

3 豬遺傳育種方面對lncRNA的研究

3.1 lncRNA在豬胚胎上的研究

胚胎發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，胚胎發(fā)育后細胞進而分化為不同的組織或器官，最后發(fā)育為完整的個體。相關(guān)研究表明lncRNA可以影響豬的胚胎活動。2013年，Han等[4]對豬胚胎和胎盤中H19的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)孤雌胎兒和胎盤與正常受精卵中表達的H19不同。2016年，Li等[5]對豬受精卵植入前胚胎發(fā)育過程中的lincRNA進行了基因鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA與細胞周期的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和代謝活動有關(guān)，并能夠調(diào)節(jié)受精卵的基因活動。2016年李競宇[6]對豬早期胚胎的lncRNA進行了全面分析，發(fā)現(xiàn)其中有2個高表達的lncRNA對豬的胚胎發(fā)育有一定的影響。

3.2 lncRNA在豬繁殖上的研究

繁殖性狀是豬重要的經(jīng)濟性狀，受到許多研究者和工作者的重視，通過深入研究繁殖性狀相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的關(guān)系，可以為豬的育種工作提供理論基礎(chǔ)，進而有效提高豬的繁殖力。2011年，Anna等[7]對伊比利亞豬和大白豬的睪丸進行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一部分lncRNA的轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)座子的組成；同時發(fā)現(xiàn)大白豬和伊比利亞豬參與精子發(fā)生和脂代謝的基因差異較大，說明大白豬和伊比利亞豬2個品種在繁殖力和脂肪沉積方面的表型差異一致。2016年，Ran等[8]對豬出生后30 d和180 d的未成熟和成熟的睪丸組織進行分析，發(fā)現(xiàn)這2個時間點之間存在許多差異，包括生精小管和間質(zhì)結(jié)締組織的直徑，以及生精細胞和支持細胞的數(shù)量，然后對基因組進行測序，共檢測到了101個差異表達的lncRNA。2017年，Wang等[9]分析豬子宮內(nèi)膜在妊娠和非妊娠時期的lncRNA和cRNA，結(jié)果表明2組間37個mRNA、34個lncRNA和1個miRNA差異顯著，進一步進行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些RNA參與了細胞粘附、結(jié)合、核酸代謝等多種生物學(xué)過程。2017年，Weng等[10]對豬的睪丸發(fā)育過程進行了lncRNA鑒定，發(fā)現(xiàn)lncRNA的靶基因參與調(diào)控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的代謝途徑。

3.3 lncRNA在豬肉質(zhì)上的研究

越來越多的消費者注重肉質(zhì)的口感，肉質(zhì)性狀作為豬的主要遺傳性狀，其遺傳力水平相對偏低，因此，需要分子輔助標記對肉質(zhì)性狀進行輔助選育，進而改善肉質(zhì)。2014年，Zhou等[11,12]對93個豬樣本進行RNA-seq，首次對豬lincRNA進行全面的分析；同時，對豬脂肪和肌肉中l(wèi)incRNA的甲基化模式進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測到的某些lincRNA在豬脂肪和肌肉中表現(xiàn)出不同程度的甲基化，這為以后lincRNA在肉質(zhì)中的進一步研究提供了理論支持。2017年，Liu等[13]對瘦肉型豬（杜洛克豬）和肥胖型豬（陸川豬）進行了lncRNA表達譜的分析，結(jié)果證明lncRNA在脂肪沉積中起調(diào)控作用。2017年，Sun等[14]使用 RNA-Seq和 miRNA-Seq檢測了長白豬和藍塘豬背最長肌中蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本和非編碼RNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)了547個差異表達基因，這給不同肌纖維在不同品種間的發(fā)育提供了分子研究的參考依據(jù)。

3.4 lncRNA在其他方面的研究

lncRNA不僅可以調(diào)控動植物的生殖細胞，還可對豬的肌內(nèi)脂肪造成一定影響，同時也對豬的某些疾病產(chǎn)生影響。2016年，Xia等[15]對高能量飲食誘導(dǎo)的非酒精脂肪性肝炎（NASH）小型豬的lncRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA可以影響NASH，多種差異表達的lncRNA可調(diào)控NASH相關(guān)靶蛋白編碼基因。2017年，Xing等分析淮南雄性豬肌肉中l(wèi)ncRNA對睪酮缺乏癥的影響時，發(fā)現(xiàn)lncRNA及其靶基因參與了睪酮缺乏癥相關(guān)的骨骼肌生長的調(diào)控。2018年，Yu等研究了lncRNA MEG3在骨骼肌發(fā)育中的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌中MEG3序列較為保守，且會參與豬早期骨骼肌的分化和維持。2018年，Che等對豬脾臟相關(guān)lncRNA進行了研究，發(fā)現(xiàn)了不同發(fā)育階段的脾臟相關(guān)lncRNA具有較大的差異，這為研究動物脾臟的分子機制提供了基礎(chǔ)。

4 展望

目前關(guān)于lncRNA的研究大多還處于探索階段，lncRNA真正的作用機制還不明確，而且lncRNA在豬上的研究還較少，關(guān)于豬lncRNA的數(shù)據(jù)庫還不完善。ALDB（The domestic animal lncRNA database） 數(shù)據(jù)庫是針對家畜lncRNA所建立的，該數(shù)據(jù)庫可以為研究家畜的lncRNA提供參考。

未來如何研究豬lncRNA的調(diào)控機制，通過同一個體的不同部位或者不同個體之間的相同部位進行研究，仍需要研究者進一步的探索。當(dāng)前，運用測序手段可以了解更多的未知lncRNA，進而為豬肌肉組織性狀、繁殖性狀等的研究提供理論依據(jù)。豬作為重要的家畜，不論在肉質(zhì)性狀還是遺傳性狀方面對其lncRNA的研究都具有重要的意義，未來lncRNA在豬育種領(lǐng)域的研究中會是新的熱點。隨著對lncRNA的深入研究，其作用機制也會更廣泛地被人們所熟知。