周金慧 楊術(shù)鵬 李熠│文
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)
我國(guó)是世界上蜂蜜產(chǎn)量和出口量均處于第一位的國(guó)家,但是蜂蜜質(zhì)量不容樂(lè)觀,仍然被國(guó)際同行認(rèn)為是“價(jià)低質(zhì)次”產(chǎn)品。而蜂蜜摻假是當(dāng)前影響我國(guó)養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)健康發(fā)展的最大障礙。總體而言,我國(guó)蜂蜜年產(chǎn)量不足40萬(wàn)噸,但是市場(chǎng)的消費(fèi)量高達(dá)70萬(wàn)噸以上,其中包括出口10余萬(wàn)噸。這些數(shù)據(jù)反映了我國(guó)蜂蜜摻假的嚴(yán)重性。由于蜂蜜摻假鑒別技術(shù)受我國(guó)蜂蜜種類繁雜、蜂蜜摻假類型和工藝不斷變化的影響,一直未能定型,導(dǎo)致監(jiān)管部門(mén)無(wú)法有效地識(shí)別摻假蜂蜜,使摻假蜂蜜在市場(chǎng)泛濫[1]。
我國(guó)現(xiàn)行有效的蜂蜜產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》(GB 14963-2011)和《蜂蜜》(GH/T 18796-2012)[2-3]。其中GB 14963-2011是衛(wèi)生部制定的需強(qiáng)制執(zhí)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),側(cè)重于理化指標(biāo)和安全指標(biāo),對(duì)提高我國(guó)的蜂蜜安全性起到了至關(guān)重要的作用。但是當(dāng)前我國(guó)蜂產(chǎn)品,尤其是蜂蜜面臨著更加嚴(yán)重的摻雜使假問(wèn)題,但是在該標(biāo)準(zhǔn)中未能就蜂蜜真實(shí)性指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定。因此,中華全國(guó)供銷合作總社在該標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上結(jié)合養(yǎng)蜂生產(chǎn)實(shí)際情況制定了新的推薦性的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GH/T 18796-2012),在該標(biāo)準(zhǔn)中加入與加工和貯藏條件相關(guān)的參數(shù)和碳-4植物糖含量等蜂蜜真實(shí)性指標(biāo)。然而該方法僅對(duì)在蜂蜜中加入碳-4植物轉(zhuǎn)化糖(玉米糖漿和甘蔗糖漿)的摻假蜂蜜有效,對(duì)摻入碳3植物轉(zhuǎn)化糖(甜菜糖漿、大米糖漿、木薯糖漿和小麥糖漿)是無(wú)效的;另外一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)自蜂蜜中高果糖漿的檢測(cè)-薄層色譜法(GB/T 18932.2-2002),該方法通過(guò)比較檢測(cè)樣品與陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品的薄層色譜條帶進(jìn)行定性結(jié)果判定,優(yōu)點(diǎn)是能夠清晰地顯示樣品中是否含有由于摻假導(dǎo)致的未完全轉(zhuǎn)化的寡聚糖,但缺點(diǎn)是檢驗(yàn)員的主觀性太大,容易造成結(jié)果的誤判,此外在檢測(cè)甘露蜜和進(jìn)口蜂蜜時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,從而導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上流通著大量的“指標(biāo)蜜”,即各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)完全符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的摻假蜂蜜。
目前國(guó)際上針對(duì)蜂蜜的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)主要有歐盟的2001/110/EC[4]以及2001年修改后國(guó)際食品法典委員會(huì)的Codex standard for honey[5-6]。世界各國(guó)均主要依據(jù)這兩個(gè)條例為基礎(chǔ),在本國(guó)實(shí)際情況基礎(chǔ)上分別建立各自國(guó)家的蜂蜜質(zhì)量安全法律法規(guī),包括加拿大[7],澳大利亞和新西蘭[8]和韓國(guó)[9]、希臘[10]、印度[11]、巴西[12]、塞浦路斯[13]、克羅地亞[14]、哥倫比亞[15]和中國(guó)[2-3]等。
水分含量高低是評(píng)價(jià)蜂蜜成熟度的主要標(biāo)志。加拿大依據(jù)水分含量對(duì)蜂蜜等級(jí)進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定,其中一等品水分含量<17.8%, 二等品水分含量<18.6%,三等品水分含量<20%[16]。德國(guó)、阿根廷、捷克和斯洛文尼亞等國(guó)規(guī)定蜂蜜中水分含量必須低于18%[17]。我國(guó)現(xiàn)行蜂蜜安全標(biāo)準(zhǔn)GB 14963-2011沒(méi)有設(shè)定水分指標(biāo),行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796 2012中水分限量按等級(jí)和類別劃分。一等品中荔枝等5種蜂蜜23%,其他26%,二等品中荔枝等5種蜂蜜20%,其他24%。相對(duì)于其他國(guó)家,我國(guó)水分含量要求普遍偏低,因此設(shè)定了7項(xiàng)包括嗜滲酵母在內(nèi)的微生物指標(biāo)的限量要求,而在其他各國(guó)未做要求。
羥甲基糠醛是評(píng)價(jià)蜂蜜是否高溫加工和儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的主要指標(biāo)。德國(guó)、捷克、斯洛文尼亞、波蘭和日本分別規(guī)定蜂蜜中羥甲基糠醛含量不得超過(guò)10~35mg/kg,哥倫比亞作為熱帶國(guó)家將糠醛含量由原來(lái)的60mg/kg改為80 mg/kg。但是部分國(guó)家要求更低,如韓國(guó)和印度要求均超過(guò)了80mg/kg[18]。我國(guó)要求不得超過(guò)40mg/kg,針對(duì)蜂蜜中羥甲基糠醛的要求與其他國(guó)家相比處于中等水平。
酶值是衡量蜂蜜新鮮度和成熟度的指標(biāo)之一。波蘭要求蜂蜜酶值大于8.3,而俄羅斯是唯一1個(gè)要求每1個(gè)蜜種設(shè)定1個(gè)酶值的國(guó)家,其中洋槐>5,椴樹(shù)蜜>11,向日葵蜜>15,蕎麥米>18,而其他蜜種>7,同時(shí)如果酶值低于3的蜂蜜其糠醛含量必須低于15mg/kg[19]。而我國(guó)的要求相對(duì)較低,荔枝蜂蜜、龍眼蜂蜜、柑橘蜂蜜、鵝掌柴蜂蜜這4種蜂蜜酶值≥2,其他蜜種的蜂蜜≥4。
葡萄糖和果糖是蜂蜜主要糖類物質(zhì),同時(shí)也是判斷是否為蜂蜜或成熟蜂蜜的指標(biāo)之一。國(guó)內(nèi)和大部分國(guó)際蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)中葡萄糖和果糖限量值都是60%~65%,而加拿大、阿根廷、巴西、哥倫比亞、埃塞俄比亞、印度、俄羅斯和塞爾維亞該指標(biāo)設(shè)定為不得低于65%[20]。
世界各個(gè)國(guó)家對(duì)蜂蜜中污染物限量都有相應(yīng)的規(guī)定。我國(guó)設(shè)定了鉛的限量為1.0 mg/kg。對(duì)于農(nóng)獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō),日本除對(duì)少數(shù)農(nóng)獸藥單獨(dú)規(guī)定其限量值外,其余藥物均實(shí)行肯定列表制度,即采用一律標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg。歐盟對(duì)于農(nóng)獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)主要有主要的法規(guī)有96/2005/EC、149/2008/EC、2377/90/EEC等,包括47項(xiàng)農(nóng)藥殘留,29項(xiàng)獸藥殘留,其中27項(xiàng)為禁用獸藥,其農(nóng)藥最大殘留限量一般在0.01~0.05mg/kg之間[21-22]。我國(guó)蜂蜜限量指標(biāo)主要有四環(huán)素族抗生素、8種磺胺類藥物、氟氯苯菊酯、溴螨酯、蠅毒磷、雙甲脒等,其限量值在0.01~0.1mg/kg,其限量值基本與歐盟標(biāo)準(zhǔn)持平或高于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。
我國(guó)蜂群總量高達(dá)900多萬(wàn)群,其中600多萬(wàn)群是意大利蜜蜂,主要分布在平原地區(qū),采用轉(zhuǎn)場(chǎng)方式追花逐蜜生產(chǎn)蜂蜜;另外300萬(wàn)群為中華蜜蜂,主要分布在我國(guó)廣大山區(qū),一般為定地飼養(yǎng)。意大利蜂蜜的生產(chǎn)能力強(qiáng),是我國(guó)商品蜂蜜主要組成部分。蜂農(nóng)為了充分發(fā)揮意蜂的采集能力,通常會(huì)在一定的區(qū)域甚至全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行不斷轉(zhuǎn)場(chǎng),充分利用不同地域蜜源植物的種類及花期的差異進(jìn)行蜂蜜生產(chǎn)。在生產(chǎn)過(guò)程中,蜂農(nóng)通常有意識(shí)的生產(chǎn)單花蜜,主要是單花蜜的價(jià)格較高、口感較好,尤其是洋槐蜜、椴樹(shù)蜜等。中蜂的生產(chǎn)能力較弱,但善于利用零星蜜源,從而導(dǎo)致生產(chǎn)的中蜂蜜基本上以雜花蜜為主。綜上可知,意大利蜜蜂生產(chǎn)的單花蜜是我國(guó)商品蜂蜜最主要的組成部分。如何有效的評(píng)價(jià)單花蜜是開(kāi)展優(yōu)質(zhì)蜂蜜檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵。
不同單花蜜中的物質(zhì)種類和含量均存在一定差異,基于此差異,便可以有效建立單花蜜評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法。通常情況下,將目標(biāo)物質(zhì)的含量在其一定范圍內(nèi)視為單花蜜,否則將其視為非其他單花蜜或者雜花蜜。在這種情況下,參考單花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣本庫(kù)的構(gòu)建非常關(guān)鍵,如何取樣、儲(chǔ)存和鑒定是樣本庫(kù)建設(shè)中需要考慮的關(guān)鍵點(diǎn)。鑒于單一花種蜂蜜參考樣品在不同年份和不同生產(chǎn)區(qū)域之間存在成分差異,我們建議將篩選出的目標(biāo)特征物含量占同品種參考樣品50%以上的樣品視作單一花種優(yōu)質(zhì)蜂蜜。
我國(guó)主要蜜源植物有油菜、洋槐、荊條、棗花、荔枝、龍眼、椴樹(shù)、柑橘、鴨腳木、烏桕、苕子、野壩子、石榴、老瓜頭、棉花、枸杞、五倍子、向日葵、桉樹(shù)等。糖類、水分、有機(jī)酸、游離氨基酸、有機(jī)堿、酚酸、黃酮和蛋白質(zhì)等是構(gòu)成蜂蜜的主要物質(zhì)。除去蜂蜜中的糖類、蛋白質(zhì)、水分、無(wú)機(jī)物等,蜂蜜還含有小于5%的有機(jī)物質(zhì),如何識(shí)別、鑒定和定量這些有機(jī)物質(zhì)是理解不同單花蜜的關(guān)鍵,也是研究的重點(diǎn)。在蜂蜜中5%的有機(jī)物質(zhì)中,不同單花蜜之間存在一定的相同物質(zhì),但是其含量往往存在差異[23]。依據(jù)新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部的新標(biāo)準(zhǔn),蜂蜜中4-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸、和3-(4-羥基苯基)乳酸)的含量應(yīng)大于1 mg/kg;此外,還規(guī)定3-苯基乳酸大于400mg/kg時(shí)為麥盧卡單花蜜,20~400mg/kg時(shí)為麥盧卡雜花蜜[24]。除了麥盧卡之外,國(guó)際上還對(duì)其他種類的蜂蜜的鑒定提供了有意義的探索,比如板栗蜂蜜中的犬尿酸應(yīng)大于10mg/kg[25]、柑橘蜜中的咖啡因應(yīng)大于2mg/kg[26]等。上述研究均是基于蜂蜜中固有化學(xué)物質(zhì)的含量用于評(píng)價(jià)單花蜜的品質(zhì),這為我們研究我國(guó)的主要單花蜜提供了非常有益的參考。此外,該方式不僅可以評(píng)估單花蜜品質(zhì),也可為不同蜂蜜的混摻和蜂蜜摻假的鑒別提供輔助建議。不同蜂蜜的混摻也是當(dāng)前影響蜂蜜品質(zhì)關(guān)鍵因素之一,油菜、柑橘、向日葵、棉花、烏桕等大宗單花蜜,通常我們很難在市場(chǎng)上見(jiàn)到這些單花蜜,盡管這些蜂蜜的產(chǎn)量很大。究其緣由,主要是這類蜂蜜口感、色澤較差,或者是具有易于發(fā)酵等弊端。這些蜂蜜往往通過(guò)混入其他種類的蜂蜜中,采用以次充好的方式,冒充其他優(yōu)質(zhì)單花蜜。除此之外,不同單花蜜中的蛋白質(zhì)含量差異、花粉形態(tài)差異、單糖種類差異等均可為表征單花蜜提供有益的數(shù)據(jù)[27-30]。
盡管我國(guó)蜂蜜產(chǎn)量位居全球第一,但是有關(guān)蜂蜜中內(nèi)源性物質(zhì)的研究較為匱乏。至今,我國(guó)尚未頒布一種關(guān)于單花蜜的國(guó)家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或方案。鑒于此,本研究團(tuán)隊(duì)采用液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件Compound Discovery 2.0對(duì)我國(guó)主要單花蜂蜜中內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行了全組分分析,以期獲得各種單花蜜中主要和特征性的化學(xué)物質(zhì)。目前,本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)完成了我國(guó)20余種主要單花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)的分析和鑒定工作,如油菜蜜中油菜素-1和油菜素-2、棗花蜜中的棗花素-1和棗花素-2、洋槐蜜中的洋槐素-1、洋槐素-2和洋槐素-3、荊條蜜中的荊條素-1和荊條素-2、荔枝蜜中的荔枝素-1和荔枝素-2等。這些已鑒定出來(lái)的物質(zhì)在單花蜜中的含量介于1~400ppm,基于其含量的高低可以有效的表征單花蜜的純度和品質(zhì)??紤]到我國(guó)蜜源植物因地理位置、品種和年份的差異,單花蜜中各主要物質(zhì)的含量會(huì)存在一定的波動(dòng)。因此,在制定各單花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)含量閾值時(shí),需要科學(xué)論證,并不斷更新,使其更科學(xué)合理。通過(guò)借鑒麥盧卡蜂蜜的新標(biāo)準(zhǔn),本研究團(tuán)隊(duì)首先制定了優(yōu)質(zhì)棗花蜜的標(biāo)準(zhǔn),規(guī)定優(yōu)質(zhì)棗花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)棗花素-1和棗花素-2的含量應(yīng)該不低于其在棗花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣的中50%(兩者在棗花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣中的含量均值分別為25mg/kg和3mg/kg),而介于20%~50%的稱之為棗花蜜的雜花蜜,對(duì)于那些內(nèi)源性物質(zhì)小于20%,將其歸為雜花蜜。同樣,此方案也推廣到其他優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)的制定中。此外,不同單花蜜中的蛋白質(zhì)含量差異、花粉形態(tài)差異、單糖種類差異等均可為表征單花蜜提供有益的參考數(shù)據(jù)。在優(yōu)質(zhì)單花蜜制定過(guò)程中,不斷增加有關(guān)其他檢測(cè)項(xiàng)目,以期制定的優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)更科學(xué)合理。
目前國(guó)際上有關(guān)蜂蜜摻假的鑒別技術(shù)主要分為兩種方式,一種是采用靶向分析法,檢測(cè)摻入糖漿中的特征性標(biāo)志物,用于表征蜂蜜的真實(shí)性[9,31];另外一種是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種非靶向分析,即輪廓分析法,主要是采用核磁共振或者液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)蜂蜜中固有的成分進(jìn)行分析[32-33]。就目前有關(guān)蜂蜜摻假檢測(cè)機(jī)構(gòu)匯總的結(jié)果來(lái)看,目前,任何一種檢測(cè)方法均不能夠有效的鑒別蜂蜜摻假,均需要多種蜂蜜摻假方法綜合運(yùn)用,方能有效鑒別摻假蜂蜜。但是多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用具有耗時(shí)、成本高、低通量等缺點(diǎn),遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前蜂蜜摻假的需要。
糖類主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等其他單糖、雙糖甚至多糖組成,其總含量往往大于65%。蜂蜜中混入的糖漿主要是來(lái)源于小麥、大米、玉米等作物。糖漿的生產(chǎn)主要是基于淀粉的水解、異構(gòu)化和純化等工藝實(shí)現(xiàn)的。在生產(chǎn)過(guò)程中,往往會(huì)引入一些異源性的糖類物質(zhì),那些顯著區(qū)別于蜂蜜中的糖類物質(zhì)便可作為潛在的蜂蜜摻假標(biāo)志物,用于蜂蜜摻假的識(shí)別。本研究團(tuán)隊(duì)基于核磁共振和液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜等技術(shù),在糖漿樣本中篩選出了多個(gè)顯著區(qū)別于蜂蜜中糖類的物質(zhì),并基于此,建立了蜂蜜中糖漿摻假鑒別液相串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)的方法。通過(guò)對(duì)120余種蜂蜜摻假盲樣的考核,結(jié)果表明該方法對(duì)蜂蜜摻假的準(zhǔn)確率高達(dá)98.3%,顯著高于國(guó)內(nèi)同行業(yè)有關(guān)蜂蜜摻假的鑒別水平。本團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)蜂蜜摻假方法簡(jiǎn)單高效,這為優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)制定提供了有效保障,也為凈化國(guó)內(nèi)蜂蜜摻假的市場(chǎng)亂象提供了有力的技術(shù)支撐。
除了真實(shí)性之外,蜂蜜的成熟度技術(shù)指標(biāo)也是行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn),目前除了甘油(丙三醇)和脯氨酸兩個(gè)指標(biāo)外,其他指標(biāo)還不夠成熟,歐盟實(shí)驗(yàn)室對(duì)脯氨酸的控制標(biāo)準(zhǔn)是小于等于180mg/kg,南非的蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定脯氨酸含量不低于200mg/kg;在我國(guó)由于商品蜂蜜品種較多,不同品種之間含量差異較大,很難形成統(tǒng)一的成熟指標(biāo),根據(jù)蜜種不同設(shè)定脯氨酸的指標(biāo)更為適宜。甘油(丙三醇)也是評(píng)價(jià)蜂蜜質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,因?yàn)槟透邼B透壓的微生物能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為多羥基化合物,其中主要的就是甘油;此外,不成熟的低濃度蜂蜜在保存過(guò)程中極易產(chǎn)生微生物,導(dǎo)致甘油含量增加。因此蜂蜜中甘油含量水平不僅僅是蜂蜜的主要品質(zhì)指標(biāo),也是成熟度指標(biāo)。本團(tuán)隊(duì)測(cè)試了全國(guó)67批次蜂蜜樣品,平均值為272mg/kg,目前我國(guó)出口歐盟蜂蜜的甘油含量必須滿足低于300mg/kg要求,現(xiàn)階段在其他蜂蜜成熟度評(píng)價(jià)指標(biāo)還不成熟的前提下,甘油可以作為評(píng)價(jià)優(yōu)質(zhì)蜂蜜成熟度的指標(biāo)。
基于上述分析及測(cè)試結(jié)果,單一花種蜂蜜的特征物質(zhì)含量和甘油含量可以推薦作為下一步優(yōu)質(zhì)蜂蜜產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)的質(zhì)量控制技術(shù)指標(biāo),其中洋槐蜜中的洋槐素-1、洋槐素-2和洋槐素-3含量分別不低于16mg/kg、15mg/kg和6mg/kg,棗花蜜的棗花素-1和棗花素-2的含量分別不低于12mg/kg和1mg/kg,且甘油含量低于300mg/kg可視作優(yōu)質(zhì)蜂蜜產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)和品牌創(chuàng)建,對(duì)引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
本項(xiàng)目受國(guó)家蜂業(yè)提質(zhì)工程專項(xiàng)資助。