楊寧 伏杰 尹家樂

[摘要] 目的 探討洛貝林對慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響。 方法 采用隨機數(shù)字表法將48只2月齡的小鼠分為4組，常規(guī)喂養(yǎng)。一組為空白對照組，其余三組均制備坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型（CCI）：模型組（CCI+腹腔注射生理鹽水），小劑量洛貝林組（CCI+腹腔注射3 mg/kg洛貝林溶液），大劑量洛貝林組（CCI+腹腔注射6 mg/kg洛貝林溶液）。應(yīng)用Von Fery機械測痛法及曠場實驗于造模后第1、8、22天給藥后測定小鼠痛閾及活動程度。 結(jié)果 痛閾值的測定中，與空白對照組比較，模型組在造模后第1、8、22天均下降（P < 0.05）；與模型組比較，三次實驗中大劑量洛貝林組均有升高（P < 0.05）。曠場實驗中，與空白對照組比較，模型組在第1、22天中總路程和平均速度顯著降低（P < 0.01）；與模型組比較，大劑量洛貝林組于造模后第22天總路程和平均速度均有顯著提高（P < 0.01），活動次數(shù)明顯提高（P < 0.05）。 結(jié)論 6 mg/kg洛貝林溶液能夠使慢性神經(jīng)病理性疼痛小鼠痛閾值升高，并且能夠改善小鼠的抑郁樣行為。

[關(guān)鍵詞] 洛貝林；神經(jīng)病理性疼痛；抑郁；曠場實驗；痛閾

[中圖分類號] R741 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of Lobeline on chronic neuropathic pain. Methods Forty-eight mice aged 2 months were divided into 4 groups by random number table method and fed routinely： one group was blank control group， and chronic constriction injury model of sciatic nerve were prepared in the other three groups； model group （CCI + intraperitoneal injection of saline）， low dose Lobeline group （CCI + intraperitoneal injection of 3 mg/kg Lobeline solution）， high dose Lobeline group （CCI + intraperitoneal injection of 6 mg/kg Lobeline solution）. The pain threshold and activity level of mice were measured by Von Fery mechanical pain measurement and open field test on the 1st， 8th， and 22nd days after injection. Results In the determination of pain threshold， the model group decreased on the 1st， 8th， and 22nd days after injection compared with the blank control group （P < 0.05）. While compared with the model group， the high dose Lobeline group was elevated in the three experiments （P < 0.05）. In the open field experiment， compared with the blank control group， the total distance and average speed of the model group significantly decreased on the 1st and 22nd days （P < 0.01）. Compared with the model group， the total distance and mean velocity of the high dose Lobeline group on the 22th day increased significantly （P < 0.01）， and the number of activities was improved （P < 0.05）. Conclusion The 6 mg/kg Lobeline solution can increase the threshold of mice with chronic neuropathic pain and improve the mice′s depression-like behavior.

[Key words] Lobeline； Neuropathic pain； Depression； Open field test； Pain threshold

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是人類最難治療的疾病之一，其嚴重影響患者身心健康，降低患者生活質(zhì)量，因其發(fā)病的機制尚未完全明確，嚴重阻礙了其治療方法的研究進程。國際疼痛研究協(xié)會（IASP）將疼痛定義為一種不愉快的感覺和情感體驗，它往往與實際或潛在的損傷相聯(lián)系，或以患者受傷害的角度來進行描述的一種癥狀[1]。與此同時，NPP的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，尋找新型高效的治療措施是目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點[2]。臨床上應(yīng)用的主要一線藥物有三環(huán)類抗抑郁藥和抗癲癇藥物，但多數(shù)治療效果仍不令人滿意[3]。有研究表明，煙堿型乙酰膽堿受體是治療慢性神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點[4]。1526年，西班牙歷史學(xué)家Oviedoy Valdes首先發(fā)現(xiàn)煙草可以緩解梅毒患者的疼痛[5]。20世紀煙堿從煙草中提取出來，并證實了其具有緩解疼痛的作用[6]。

煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）主要分為神經(jīng)型受體和肌肉型受體。前者作為鎮(zhèn)痛治療的相關(guān)靶點被重點研究。洛貝林是神經(jīng)型nAChRs激動劑，其對慢性神經(jīng)病理性疼痛的作用，尚缺乏相關(guān)研究。

神經(jīng)病理性疼痛與抑郁之間存在共病聯(lián)系。臨床研究表明，30%的神經(jīng)病理性疼痛患者表現(xiàn)出抑郁、焦慮狀態(tài)，而50%的抑郁患者伴隨疼痛癥狀[7]。慢性疼痛患者極易產(chǎn)生負面情緒，包括抑郁和焦慮，故抑郁和疼痛的病理性發(fā)病機制宏觀上可能具有一致性[8]，兩者存在許多可能的共同機制，如免疫激活、單胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙、神經(jīng)營養(yǎng)因子合成與分泌紊亂、基因與表觀遺傳學(xué)機制等[9]。本研究通過坐骨神經(jīng)結(jié)扎法建立慢性神經(jīng)病理性疼痛模型，探討洛貝林對小鼠慢性疼痛及其引起的抑郁情緒是否有緩解作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸洛貝林注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：06161105），DigBehv動物行為分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司），Electronic Von Frey測痛儀（美國IITC公司）。

1.2 實驗動物及分組

2月齡健康雄性昆明小鼠48只，體重25～40 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供（合格證號：SCXK蘇2015-0009），標準化飼養(yǎng)。所有與動物飼養(yǎng)和操作都遵循國際動物保護協(xié)會和國際疼痛研究學(xué)會組織的相關(guān)規(guī)定，并獲得徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準。采用隨機數(shù)字表法將48只小鼠分為4組，即空白對照組、模型組、小劑量洛貝林組、大劑量洛貝林組，每組12只。坐骨神經(jīng)結(jié)扎造模成功后，模型組、小劑量洛貝林組、大劑量洛貝林組于每次實驗前20 min分別腹腔注射生理鹽水、3 mg/kg鹽酸洛貝林溶液、6 mg/kg鹽酸洛貝林溶液，給藥體積為10 mL/kg。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型的建立 依據(jù)Bennet方法[10]，對模型組、小劑量洛貝林組、大劑量洛貝林組大鼠制備坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型（CCI）。小鼠腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，于一側(cè)后肢外側(cè)剪毛備皮，碘伏消毒皮膚，沿股骨外側(cè)做一縱形切口順紋理鈍性分離腿部肌肉，暴露并游離坐骨神經(jīng)中上段8 mm，用4-0醫(yī)用鉻制羊腸線間隔1 mm結(jié)扎3處，結(jié)扎時以肢體輕微抽動為力度標準，使神經(jīng)外膜輕度凹陷但不阻斷血供，縫合，消毒。

1.3.2 機械痛閾測量 Von Fery法采用up-down法[11]于造模后第1、8、22天對各組小鼠的機械痛閾進行測定。將小鼠放入觀察籠中15 min適應(yīng)環(huán)境，以不同粗細的Von Fery纖維絲自金屬篩網(wǎng)下垂直刺激小鼠患側(cè)足底中部，持續(xù)4 s內(nèi)小鼠有抬足、躲避或舔腳動作視為陽性反應(yīng)，纖維彎曲90℃無抬足反應(yīng)，視為陰性；從1.0 g開始，如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，繼續(xù)給予相鄰高強度的刺激，同一克數(shù)纖維絲反復(fù)操作5次，兩次操作間隔5 min，發(fā)生3次或以上陽性反應(yīng)的最小克數(shù)作為該動物的機械痛閾值，每次實驗測量時間為12：00～14：00。

1.3.3 曠場實驗 利用計算機控制的DigBehv動物行為分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司），采用曠場實驗對各組小鼠行為進行檢測，時間固定在上午8：00～12：00進行，開放場區(qū)域為80 cm×40 cm分為9個象限，檢測時間長度為4 min，由紅外攝像系統(tǒng)和視頻合成器記錄小鼠的活動情況，計算機分析系統(tǒng)分析小鼠的運動軌跡，監(jiān)視及分析活動次數(shù)、總路程、運動速度以觀察其抑郁程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t和SNK（S）-q檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗；同組不同時間點比較采用重復(fù)測量的方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機械痛閾測定結(jié)果組間比較

四組小鼠痛閾基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與空白對照組比較，模型組造模后第1、8、22天的痛閾值明顯下降（P < 0.05）；在第1、8、22天，大劑量洛貝林組與模型組比較，痛閾值升高且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 機械痛閾測定結(jié)果組內(nèi)比較

空白對照組中，與第1天比較，第22天痛閾差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；模型組中，與造模后第1天比較，造模后第8天和第22天痛閾差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；小劑量洛貝林組中，與造模后第1天比較，造模后第8天痛閾差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；大劑量洛貝林組中，與造模后第1天比較，造模后第8天和第22天痛閾差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 曠場實驗結(jié)果

2.3.1 第1天結(jié)果 與空白對照組比較，模型組總路程縮短和平均速度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，小劑量洛貝林組和大劑量洛貝林組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.3.2 第8天結(jié)果 與空白對照組比較，模型組和小劑量洛貝林組總路程縮短和平均速度下降且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，小劑量洛貝林組和大劑量洛貝林組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.3.3 第22天結(jié)果 與空白對照組比較，模型組總路程縮短且差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），平均速度下降（P < 0.05），而小劑量洛貝林組、大劑量洛貝林組與之對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與模型組比較，大劑量洛貝林組總路程延長、平均速度加快，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），活動次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而小劑量洛貝林組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

3 討論

CCI模型作為最常用的NPP模型之一，其產(chǎn)生的疼痛癥狀和行為與NPP患者的臨床表現(xiàn)很大程度上具有一致性，故廣泛應(yīng)用于NPP機制及鎮(zhèn)痛藥物的篩選研究[12]。

本研究模擬臨床給藥方式，通過在體實驗評估洛貝林使用對小鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響。洛貝林，又名山梗菜堿，是一種親脂性的非吡啶生物堿，可激動N膽堿受體且可以通過血腦屏障，是一種呼吸興奮藥。Hama等[13]在行甲醛誘導(dǎo)的鼠疼痛模型中發(fā)現(xiàn)，N膽堿受體激動劑對急性或慢性組織損傷的疼痛均有鎮(zhèn)痛作用，對慢性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)相對更強。

本研究結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎造模后測量痛閾值，與空白對照組比較，模型組造模后第1天和第22天的痛閾值下降，表明NPP小鼠模型造模成功；在造模后第1、8、22天，與模型組比較，小劑量洛貝林組的痛閾水平均有所增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表明小劑量的洛貝林不能使NPP小鼠疼痛恢復(fù)到正常水平，僅起到部分緩解作用；與模型組比較，大劑量洛貝林組痛閾值升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表明大劑量的洛貝林可以充分改善小鼠的慢性神經(jīng)病理性疼痛。研究顯示，α4β2 nAChR分布最廣，可通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、多巴胺、γ氨基丁酸、去甲腎上腺等，在疼痛信號傳遞中發(fā)揮重要作用[14]，并且可以改善周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛[15]；Wieskopf等[16]認為α6 nAChR可能在介導(dǎo)疼痛感受的過程中發(fā)揮重要的作用；α7 nAChR作為治療疼痛的潛在靶點已有相關(guān)研究報道，Papke等[17]發(fā)現(xiàn)α7 nAChR受體激動劑NS6740在坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷小鼠模型中具有鎮(zhèn)痛作用；而α9α10 nAChR可能是慢性疼痛，特別是神經(jīng)性疼痛的潛在作用靶點[18]。洛貝林作為神經(jīng)型nAChR的激動劑，可能是通過激動神經(jīng)型nAChR，經(jīng)上述通路發(fā)揮緩解慢性神經(jīng)病理性疼痛的作用。

有研究認為[19]，疼痛與抑郁之間具有共同的神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸、P物質(zhì)、5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛患者中有近一半患者存在不同程度的抑郁、焦慮癥狀[20]。推測兩者之間存在一定的相關(guān)性。

本研究顯示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎造模后行曠場試驗，與空白對照組比較，第1天模型組活動程度明顯下降，表明NPP小鼠造模成功；造模后第22天模型組在總路程、平均速度的測量中相較于空白對照組有顯著的降低，表明小鼠存在抑郁情緒；而在曠場實驗中，與模型組的比較，大劑量洛貝林組3個指標數(shù)據(jù)結(jié)果均存在顯著升高，表明洛貝林顯著改善由慢性神經(jīng)病理性疼痛所引起的抑郁。

綜上所述，洛貝林能夠激動N膽堿受體，從而緩解CCI小鼠的神經(jīng)病理性疼痛，且對其伴發(fā)的抑郁情緒也有一定的緩解作用。這為臨床上神經(jīng)病理性疼痛和抑郁治療提供了一定的理論支持。

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（收稿日期：2018-05-16 本文編輯：任 念）