王雙輝WANG Shuang-hui 張 麗 鐘嬡嬡 - 金晨鐘 -

(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000；2. 湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000)

龍爪稷起源于非洲，廣泛分布于東半球熱帶及亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)長(zhǎng)江以南及安徽、西藏、河南、廣西、陜西、湖南等省均有分布[1]；在印度，其產(chǎn)量?jī)H次于小麥、高粱、玉米、珍珠粟和水稻，是一種非常重要的谷物[2]。研究表明，龍爪稷具有抗癌[3]、抗氧化與抗衰老[4]、抗高血脂與保護(hù)心臟[5]、預(yù)防肥胖[6]和預(yù)防糖尿病[7]等保健功能；龍爪稷含有豐富的多酚、礦物質(zhì)、膳食纖維和含硫氨基酸[8]，其中多酚含量遠(yuǎn)高于糙米、小麥、燕麥、玉米4種谷物[9]。

有機(jī)溶劑提取法、超臨界萃取法、超聲波和微波輔助浸提法等是植物多酚的主要提取方法[10]。但這些方法得到的多酚提取物純度不高，黏性大，后續(xù)處理難度較大，不利于多酚的分離與純化。超聲波輔助浸提法可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率，從而縮短提取時(shí)間，提高收率。雙水相萃取技術(shù)是根據(jù)組分在兩個(gè)不相容的水相間的分配差異實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的分離，是一種新型的植物活性成分分離技術(shù)[11]?；谝掖嫉人苄缘图?jí)醇與無(wú)機(jī)鹽形成的新型雙水相體系與傳統(tǒng)聚合物-無(wú)機(jī)鹽體系相比，后續(xù)處理更容易、成本更低，且表現(xiàn)出良好的分離性能[12]，已廣泛用于植物活性成分的提取[13]。超聲波輔助低級(jí)醇-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系提取技術(shù)已應(yīng)用于茶多酚[14-15]、路邊青總多酚[16]、神秘果種子多酚[17]、石榴皮多酚[18]等多酚類物質(zhì)的提取。但國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有利用該法提取龍爪稷多酚的報(bào)道。本研究擬以湖南新化的龍爪稷種子為原料，采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取多酚，研究影響多酚得率的因素，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并研究龍爪稷多酚的抗氧化活性，為龍爪稷多酚的研究和大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍爪稷種子：湖南省隆慶農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，使用前晾干粉碎，過(guò)60目泰勒標(biāo)準(zhǔn)篩；

沒(méi)食子酸：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；

超聲波清洗器：KQ-300DE型，昆山超聲儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：L530型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

可見光分光光度計(jì)：7230G型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為0，5，10，20，30，40，50，100 μg/mL的沒(méi)食子酸工作液，采用福林酚比色法[18]測(cè)定樣品在765 nm處的吸光度。以吸光度為Y值，沒(méi)食子酸濃度為X值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 超聲波輔助雙水相提取龍爪稷多酚及得率計(jì)算 將一定量的無(wú)水乙醇、硫酸銨、水加入到100 mL的帶塞錐形瓶中，預(yù)熱到一定溫度，加入粉碎后的龍爪稷粉末樣品1.000 0 g，待形成雙水相體系后，于超聲波清洗器中，在一定溫度條件下以200 W的功率超聲處理一定時(shí)間，3 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液于50 mL的容量瓶中即得龍爪稷多酚初提液，定容到50 mL形成母液。按1.2.1的方法測(cè)定母液中多酚在765 nm 下的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的質(zhì)量濃度(ρ)，按式(1)計(jì)算得率。

(1)

式中：

R——多酚得率，mg/100 g；

ρ——多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——母液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍爪稷多酚得率的影響：固定硫酸銨質(zhì)量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，按1.2.2的方法提取多酚，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值。

(2) 硫酸銨濃度對(duì)龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設(shè)置硫酸銨質(zhì)量濃度為0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 g/mL，按1.2.2的方法提取多酚，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值。

(3) 超聲溫度對(duì)龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.25 g/mL，超聲時(shí)間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設(shè)置超聲溫度為30，35，40，45，50，55 ℃，按1.2.2的方法提取多酚，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值。

(4) 超聲時(shí)間對(duì)龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，液料比50∶1 (mL/g)，分別設(shè)置超聲時(shí)間為10，20，30，40，50，60 min，按1.2.2的方法提取多酚，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值。

(5) 液料比對(duì)龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間20 min，分別設(shè)置液料比為30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，90∶1 (mL/g)，按1.2.2的方法提取多酚，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助雙水相提取工藝 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以龍爪稷多酚得率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、液料比5個(gè)因素為試驗(yàn)因子，建立響應(yīng)面優(yōu)化方案，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。

1.2.5 龍爪稷多酚體外抗氧化活性的測(cè)定 總還原能力、體外清除DPPH自由基能力、羥自由基清除率按照王艷等[19]的方法測(cè)定，并用同濃度的VC作對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean±SD (n=3)表示，采用SPSS 19.0的單向方差分析進(jìn)行差異比較(P<0.05)(LSD法)，以小寫字母標(biāo)注顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒(méi)食子酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可得回歸方程為：Y=0.008 3X-0.035 1，R2=0.999 5，說(shuō)明線性關(guān)系較好，可用于多酚濃度的計(jì)算。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍爪稷多酚得率的影響 由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在25～40%時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，龍爪稷多酚的得率增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大；隨后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚得率不斷減少，可能是過(guò)高的乙醇濃度導(dǎo)致大分子沉淀，間接導(dǎo)致多酚沉淀[20]。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%作為響應(yīng)面優(yōu)化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 硫酸銨濃度對(duì)龍爪稷多酚得率的影響 由圖2可知，隨著硫酸銨濃度的增加，龍爪稷多酚的得率增大，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度超過(guò)0.30 g/mL時(shí)，多酚得率稍有下降，但差異不顯著。這是由于雙水相體系實(shí)際是乙醇和硫酸銨爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程，隨著硫酸銨濃度的增加，上相中水分子減少，乙醇在上相中的濃度增大，多酚在上相中的溶解度增大[21]；隨著硫酸銨的繼續(xù)增加，硫酸銨在下相中已達(dá)到飽和，其含量的增加僅增加了未溶解的固體硫酸銨，對(duì)雙水相體系的影響不大，故隨著硫酸銨濃度的繼續(xù)增加，多酚得率變化不顯著。因此，選擇硫酸銨濃度為0.30 g/mL作為響應(yīng)面優(yōu)化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 超聲溫度對(duì)龍爪稷多酚得率的影響 由圖3可知，溫度<40 ℃時(shí)，多酚得率隨著溫度的增大而增大；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，得率最大；當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，多酚得率下降。這是由于隨著溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，傳質(zhì)速率增大，多酚得率增大；但當(dāng)溫度繼續(xù)增大時(shí)，多酚的氧化加劇，得率下降[22]。因此，選擇超聲溫度為40 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化的中值。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)多酚龍爪稷得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，龍爪稷多酚得率增大；但當(dāng)超聲時(shí)間>30 min時(shí)，多酚得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，這是由于當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，多酚溶解已接近飽和，而由于多酚化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，如降解、氧化等原因使多酚得率下降[23]。因此，選擇超聲時(shí)間為30 min作為響應(yīng)面優(yōu)化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 液料比對(duì)龍爪稷多酚得率的影響 當(dāng)液料比為30∶1～60∶1 (mL/g)時(shí)，多酚得率隨著液料比的增大而增大；在60∶1 (mL/g)時(shí)達(dá)到頂峰；繼續(xù)增大液料比，多酚得率無(wú)顯著性差異(圖5)。這是由于在提取過(guò)程中，隨著液料比的增大，傳質(zhì)推動(dòng)力增大，傳質(zhì)速率增大，得率增大；當(dāng)液料比>60∶1 (mL/g)時(shí)，龍爪稷多酚溶解已達(dá)到飽和，多酚已經(jīng)充分提取出來(lái)[18]，考慮到提取成本和提取液中多酚的含量，選擇液料比為60∶1 (mL/g)作為響應(yīng)面優(yōu)化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、液料比為因變量并確定其水平，結(jié)果見表1。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以龍爪稷多酚得率為響應(yīng)值 (Y)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素水平和編碼

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析 對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=317.77+4.46A+0.55B+19.67C-4.07D+2.15E-7.13AB+4.82AC+6.26AD-2.73AE+5.06BC+6.89BD+3.33BE+1.64CD-1.62CE+0.0063DE-14.58A2-18.92B2-27.87C2-15.13D2-14.34E2。

(2)

由表3可知，該模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.956 9，變異系數(shù)CV=1.89%，信噪比19.462>4，說(shuō)明該模型擬合度較好，可用于分析和預(yù)測(cè)龍爪稷多酚得率。由方差分析可知，對(duì)龍爪稷多酚得率影響極顯著(P<0.01)的因素有A、C、D、A2、B2、C2、D2、E2，影響顯著(P<0.05)的因素為AB、AD、BD。由F值可以看出提取條件對(duì)龍爪稷多酚得率的影響大小依次為：超聲溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>液料比>硫酸銨濃度。

表3 方差分析?

? ** 表示差異極顯著(P<0.01)，* 表示差異顯著(P<0.05)。

圖6 響應(yīng)面圖和交互作用等高線

2.3.3 各因素交互作用分析及提取工藝優(yōu)化 為了更直觀更深入地了解各因素的交互作用，選擇方差分析交互作用顯著的AB、AD、BD作等高線與響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖6。由圖6(a)可知，硫酸銨濃度為0.3 g/mL時(shí)，多酚得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%達(dá)到最大，最佳工藝條件為硫酸銨濃度約為0.3 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)39%～41%。由圖6(b)表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚得率先緩慢增加，后迅速降低，說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間對(duì)多酚得率影響顯著。由圖6(c)可知，多酚得率隨著硫酸銨濃度先增加后降低，在0.3 g/mL達(dá)到最大值；最佳工藝條件為：超聲時(shí)間29～31 min，硫酸銨濃度0.29～0.31 g/mL。各等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明AB、AD、BD的交互作用顯著，與表2 的P值分析結(jié)果一致。

利用Design Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化后的模型得出最佳的提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40.95%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度41.84 ℃、超聲時(shí)間29.29 min、液料比60.37∶1 (mL/g)，在此條件下多酚得率的預(yù)測(cè)值為322.00 mg/100 g。為了方便操作，將最佳工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度42 ℃、超聲時(shí)間29 min、液料比60∶1 (mL/g)。在修正的最佳工藝下重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，龍爪稷多酚的得率為(319.15±2.31) mg/100 g，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明模型擬合度較好，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

2.4 龍爪稷多酚體外抗氧化活性結(jié)果分析

2.4.1 總還原力的測(cè)定 由圖7可知，當(dāng)濃度在100～700 μg/mL 時(shí)，多酚與VC的總還原力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且VC的總還原力大于同濃度的龍爪稷多酚；當(dāng)質(zhì)量濃度為700 μg/mL時(shí)，龍爪稷多酚的總還原力為同濃度VC的91.84%，說(shuō)明龍爪稷多酚有較強(qiáng)的總還原力。

2.4.2 對(duì)DPPH自由基的清除能力 由圖8可知，濃度低于500 μg/mL時(shí)，龍爪稷多酚和VC對(duì)DPPH自由基的清除率都隨濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)龍爪稷多酚濃度為600～700 μg/mL時(shí)，清除率無(wú)顯著變化，說(shuō)明龍爪稷多酚在600 μg/mL時(shí)已接近飽和，而VC在500 μg/mL時(shí)已接近飽和；當(dāng)濃度為700 μg/mL 時(shí)龍爪稷多酚清除率為91.74%，為同濃度VC的96.79%。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

清除率無(wú)顯著增強(qiáng)，即濃度為600 μg/mL時(shí)龍爪稷多酚的羥基自由基的清除能力已接近飽和；而VC在濃度為500 μg/mL 時(shí)已達(dá)到飽和，且其對(duì)羥基自由基的清除能力強(qiáng)于同濃度的多酚；當(dāng)多酚濃度為700 μg/mL時(shí)，龍爪稷多酚對(duì)羥基自由基的清除率為55.58%，為同濃度VC的89.03%，說(shuō)明龍爪稷多酚有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

3 結(jié)論

(1) 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程能預(yù)測(cè)超聲輔助雙水相提取龍爪稷多酚的得率。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度42 ℃、超聲時(shí)間29 min、液料比60∶1 (mL/g)，在此條件下，龍爪稷多酚得率為319.15 mg/100 g。龍爪稷中多酚含量較高，可以作為一種谷物膳食補(bǔ)充劑來(lái)補(bǔ)充多酚。

(2) 龍爪稷多酚有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，700 μg/mL的龍爪稷多酚的總還原力、對(duì)DPPH自由基的清除率和對(duì)羥基自由基的清除率分別為同濃度VC的91.84%，96.79%，89.03%；證實(shí)了龍爪稷的抗氧化活性，具有作為抗氧化劑在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用的潛力。

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