劉麗，王貴珍，周延山，楚彬，馬素潔，姬程鵬，田永亮，花立民

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)-新西蘭梅西大學(xué)草地多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070)

青藏高原是我國以及東亞氣候系統(tǒng)穩(wěn)定的重要屏障，有豐富多樣、獨具特色的特殊生態(tài)系統(tǒng)類型和珍稀動植物種類，是全球生物多樣性保護的重點區(qū)域[1]。廣布于該區(qū)的高寒草甸在畜牧業(yè)生產(chǎn)和水源涵養(yǎng)等生態(tài)保育功能中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。然而隨著氣候變化、人類干擾等因素，高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)退化嚴重，其中草原鼠害是加劇退化的重要因素[3]。高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)是青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)勢地下害鼠，當(dāng)其種群密度超過環(huán)境容量時，顯著影響到草地生產(chǎn)力和植物群落結(jié)構(gòu)[4]。但是，高原鼢鼠是土壤疏松、生物多樣性維持的關(guān)鍵物種之一，有著 “生態(tài)系統(tǒng)工程師”的美譽[5-6]。

種群遺傳分化研究是遺傳資源利用和物種保護的基礎(chǔ)[7]。遺傳多樣性是決定一個物種進化潛力和抵御不良環(huán)境能力的主要驅(qū)動力[8-9]。高原鼢鼠依靠挖掘地下洞道系統(tǒng)完成取食、擴散等行為[10]。穩(wěn)定的地下生活環(huán)境和有限的遷移能力使不同地理種群間存在嚴重的限制性基因流[11]和獨特的地域種群遺傳結(jié)構(gòu)[12]。蔡振媛等[12]通過測定線粒體控制區(qū)序列變異發(fā)現(xiàn)地理屏障與高原鼢鼠種群間遺傳距離沒有顯著相關(guān)性，種群間遺傳分化中大約79.6%的變異可以由地理隔離解釋。但這些研究多集中在較大尺度的地理區(qū)域和歷史事件對其種群結(jié)構(gòu)的影響[11-12]，小尺度特殊地理環(huán)境等對鼢鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)影響的研究較少。研究尺度的差異會對遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果解釋各異，而小尺度上的種群遺傳結(jié)構(gòu)則受到棲息地景觀模式、個體永久性遷移頻率及由于交配事件導(dǎo)致的基因擴散情況等多重因素的影響[13]。為進一步研究小尺度生境中環(huán)境因素對種群遺傳的影響，本試驗采用微衛(wèi)星標記的方法，在祁連山東段高寒草甸區(qū)小尺度下，研究不同地理位置的高原鼢鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)特點、基因交流及其影響因素，為該物種生物多樣性保護和草原鼠害防治提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地選在甘肅省天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)高寒草甸區(qū)。該區(qū)位于東祁連山的天祝金強河河谷，地理坐標為北緯37°11′，東經(jīng)102°29′，海拔 2710～3080 m。境內(nèi)地形受馬牙雪山和雷公山隆起的影響，形成東西向的峽谷地帶，西高東低。氣候寒冷潮濕，太陽輻射強。年均溫-0.1 ℃，>0 ℃年積溫1380 ℃；年降水量416 mm，多為地形雨，集中于 7、8、9 三個月。無絕對無霜期，僅分冷熱兩季。天然草地主要為高寒草甸。主要植物有垂穗披堿草(Elymusdahuricus)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、線葉嵩草(K.capillifolia)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、秦艽(Gentianamacrophylla)、扁蓿豆(Ruthenianmedic)、早熟禾(Poaannua)、狗娃花(Heteropappushispidus)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、棘豆(Oxytropisbella)、蕨麻(Potentillaanserina)、苔草(Carexhumilis)等。

1.2 試驗材料

試驗材料總共包括163個高原鼢鼠個體，試驗采樣點分別在甘肅祁連山東段高寒草甸區(qū)的馬營灘(MYT)、下南泥溝(XNG)、馬營河?xùn)|(MYR)和馬營河西(MYL)共4個樣地，如圖1所示。MYT、XNG、MYL和MYR 的樣地面積分別為7.50，1.60，1.25，1.25 hm2。其中，MYT樣地中高原鼢鼠的個體采樣點的最遠直線距離為600 m，采樣點范圍約3 hm2；XNG樣地中采樣點的最遠直線距離為500 m，采樣點范圍約1 hm2；MYL樣地中采樣點的最遠直線距離為200 m，采樣點范圍約1 hm2；MYR樣地采樣點的最遠直線距離為300 m，采樣點范圍約1.2 hm2。4個樣地共采集鼢鼠的雌性個體數(shù)量為87；雄性個體數(shù)量為76。采取典型種群隨機抽樣法，分別在2014、2015年的5、6、8月用弓箭捕獲鼢鼠，記錄鼢鼠的性別、年齡后解剖獲取部分肝臟組織，置于1.5 mL離心管中，先保存于液氮罐中，在實驗室內(nèi)轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 DNA提取及微衛(wèi)星擴增

鼢鼠肝臟組織的總DNA用上海生工生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒(Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，批號：12111677ZS)提取。操作過程中，將蛋白酶K的用量由原來的20 μL增加為40 μL，其他步驟不變。將提取好的DNA保存于-20 ℃的冰箱用于后續(xù)試驗。

試驗中SSR擴增用10個核苷酸微衛(wèi)星位點的引物(ECTI5、ECTI6、ECTI8、ECTI10、ECTI21、ECTI22、ECTI23、ECTI33、 ECTI48、ECTI49)[14]，這些位點在高原鼢鼠種群中具有多態(tài)性，可用于種群位點擴增。PCR擴增用熒光標記的引物，分別用HEX(綠光)、FAM(藍光)和TAM(黃色)熒光基團在5′端標記合成熒光引物。

擴增體系為25 μL：其中包括1 μL的模板，上下游引物各0.5 μL，dNTP 10 mmol/L 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，Taq 酶0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。用GeneAmp的PCR擴增系統(tǒng)9700，反應(yīng)循環(huán)包括95 ℃下3 min的預(yù)變性(聚合酶激活)；接著是10個循環(huán)95 ℃ 下30 s的變性；在60 ℃下退火30 s，在72 ℃延伸30 s；20個循環(huán)在95 ℃ 下變性30 s， 在55 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s；最終72 ℃溫度下再修復(fù)延伸6 min。PCR銀光標記產(chǎn)物用毛細管電泳裝置ABIPRISM3130XL的Gene Scan 500 LIZ分析計算擴增片段的大小。試驗中引物擴增以及微衛(wèi)星擴增反應(yīng)委托上海生工生物工程有限公司完成。

圖1 高原鼢鼠采樣點地理分布Fig.1 Geographic distribution of plateau zokor sampling sites along the study area MYT,MYL, MYR, XNG, 分別代馬營灘、馬營河西邊、馬營河?xùn)|邊、下南泥溝種群。下同。MYT, MYL, MYR, XNG, replace Mayingtan, the west and east side of Maying river, Xianannigou population. The same below.

1.4 統(tǒng)計分析

微衛(wèi)星屬共顯性遺傳，通過STR分型實驗得到每一擴增片段的具體大小。使用Popgene(Version 1.3)軟件GenAlex 6.4統(tǒng)計微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、遺傳相似系數(shù)(genetic similarity index,I)、種群間遺傳距離(genetic distance,Ds)、種群間近交系數(shù)(FST)、基因流(Nm)等遺傳分化系數(shù)及卡方檢驗種群哈迪溫伯格平衡[15-17]。參照Botstein等[18]的方法計算多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。利用 Structure和Distruct軟件對等位基因數(shù)據(jù)進行遺傳結(jié)構(gòu)推導(dǎo)分析，確定種群類聚數(shù)K值[13]等。用Excel整理制作相關(guān)圖、表。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

來自祁連山東段高寒草甸區(qū)4個采樣點的163個高原鼢鼠DNA樣品，在10個微衛(wèi)星位點上進行基因分型，4個種群共獲得164個等位基因(Na)，有效等位基因(Ne)為83.6。MYT、MYL、MYR、XNG種群的平均有效等位基因分別為1.79，1.66，2.17，2.75，平均觀測雜合度(Ho)分別為0.32，0.15，0.23，0.24，平均期望雜合度(He)分別為0.42，0.31，0.42，0.50，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.35，0.34，0.47，0.43。處于中等多態(tài)性水平(表1)。

表1 高原鼢鼠4個地理種群在10個微衛(wèi)星基因座的多樣性指數(shù)Table 1 The genetic diversity indices of 10 microsatellite loci for four plateau zokor populations

Ne:有效等位基因數(shù)；He:期望雜合度；Ho:表觀雜合度；PIC:多態(tài)信息含量； -：無效數(shù)值。

Ne: Number of effective alleles;He: Expected heterozygosity;Ho: Observed heterozygosity;PIC: Polymorphism information content; -: Behalf invalid value.

2.2 種群哈迪溫伯格平衡檢驗(卡方檢驗 )

基于最小Pearsonχ2估計的哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)檢驗精確P值的無偏估測對各種群的多基因座檢測(multi-locus test)發(fā)現(xiàn)，4個種群在10個位點上大多處于極顯著不平衡狀態(tài)(P<0.001)。MYT種群的位點ECTI16、ECTI48和ECTI49、MYL和MYR種群的位點ECTI48、XNG種群的位點ECTI8和ECTI21處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05)。種群MYL的ECTI8 和ECTI22位點處的基因型單一(表2)。種群偏離哈迪溫伯格平衡，表明高原鼢鼠種群間自由交流具有一定的局限性，或近親交配現(xiàn)象嚴重。

表2 種群哈迪溫伯格平衡檢驗(卡方檢驗 )Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium testing (chi-square test) of plateau zokor populations

ns,無差異顯著性(P>0.05), **差異極顯著(P<0.01),***差異極顯著(P<0.001), -,單型。

ns mean no significant difference,P>0.05, ** mean very significant difference,P<0.01, *** mean extremely significant differences,P<0.001, -, monomorphic.

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

圖2 用Structure推導(dǎo)的4個高原鼢鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)(K=2, 3, 4, 5)Fig.2 Structure analysis of 4 plateau zokor populations (K=2, 3, 4, 5)

依據(jù)貝葉斯群聚方法[19]，利用Structure和Distruct軟件[20]對研究的4個鼢鼠種群10個微衛(wèi)星座位等位基因數(shù)據(jù)進行遺傳結(jié)構(gòu)推導(dǎo)分析。結(jié)果如圖2所示，分別為當(dāng)遺傳聚類種群數(shù)K=2, 3, 4, 5時的遺傳結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)K值對后驗概率自然對數(shù)lnP(D)[21]所做的曲線圖(圖3)表明，在K=2時，lnP(D)的值最大，隨后數(shù)值都較小。分析各種群的遺傳結(jié)構(gòu)可知，本研究中 4個高原鼢鼠種群被分為 2個分類簇，分別用紅、綠兩種顏色表示，如圖2所示。即當(dāng)K=2時，4個種群被分成2組：MYT種群為一組，MYL、MYR、XNG種群聚在一起為一組。

同時參照 Evanno 等[22]的方法利用 Structure 軟件對來自 4個不同高原鼢鼠種群進行貝葉斯聚類分析，聚類分類從K=1 到K=5，每個K重復(fù)運行 10 次，每次進行了 1000000 次馬爾科夫鏈蒙特卡羅重復(fù)搜索(MCMC)，舍棄最初的 50000 次。根據(jù) ΔK方法(基于K的似然函數(shù)變動率)計算最大可能性的K值，結(jié)果為K=2(圖4)。這一結(jié)果與根據(jù)K值對后驗概率自然對數(shù)lnP(D)做曲線所得結(jié)果一致。

圖3 后驗概率自然對數(shù)[ln P(D)]與遺傳聚類種群數(shù)(K)的關(guān)系Fig.3 Relationship of ln probability data [ln P(D)] and population clusters (K)

圖4 利用 Evanno K 方法繪制不同種群分類簇K值變動Fig.4 The number of genetic clusters (K) by Delta K for different populations

用GenAlEx軟件進行高原鼢鼠居群4個不同區(qū)域163個個體基于10對SSR引物的遺傳距離的主坐標分析(PCoA)，前2個極軸坐標(Coordinate)分別解釋了高原鼢鼠種群整體遺傳變異的47.58%和8.20%。從圖 5 中可看到位于MYT樣地的個體聚為一組，而XNG、MYL、MYR三個樣地的個體傾向于聚為一組。得到類似的遺傳結(jié)構(gòu)。

圖5 基于遺傳距離的主坐標分析(PCoA)Fig.5 Principal coordinate plot of genetic distance(PCoA)

2.4 種群遺傳分化的因素分析

以不同種群間的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合近交系數(shù)(FST)與基因流(Nm)分析這4個不同地理種群間的遺傳分化情況。種群間無遺傳分化的標準值為FST=0～0.05[23]，阻止種群間遺傳分化的基因流值標準是Nm>1。如表3所示，4個不同地理種群兩兩之間的FST值都大于0.05，種群間的基因流值都小于1。種群XNG和MYR之間的基因流最大(0.616)，MYT和MYL之間的基因流最小(0.040)。XNG樣地與MYR、MYL樣地間的地理距離相當(dāng)，但MYR和MYL樣地間存在天然河流，XNG與MYR間的遺傳分化程度(0.061)小于XNG與 MYL間的(0.120)；并且河流兩側(cè)樣地MYR與MYL、MYT與MYL間遺傳分化程度分別為0.130、0.470。XNG與MYT樣地間存在公路，XNG與MYT 間的遺傳分化程度(0.339)大于XNG與 MYR間的(0.061)。綜上所述，天然河流和公路可能對種群擴散有一定的阻礙作用，特殊棲息地環(huán)境影響種群與其他種群間的信息交流。

表3 4個高原鼢鼠種群的遺傳分化程度(FST，右上角)和基因流(Nm，左下角)Table 3 Fixation index resulting from comparing subpopulations to the total population (FST, above the diagonal) and gene flow (Nm, below the diagonal) populations

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物固有的特性，是生物長期適應(yīng)與進化的產(chǎn)物。每一生物的遺傳多樣性越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強，就越容易擴展其分布范圍和開拓新的環(huán)境[24]。等位基因數(shù)是種群遺傳多樣性分析的重要參數(shù)之一[25]，本研究中高原鼢鼠種群共獲得164個等位基因，有效等位基因為83.6。種群平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.40，遺傳多態(tài)性處于中等水平，與蘇軍虎[26]的研究結(jié)果一致。棲息地破碎化及嚴重的近親繁殖，阻礙種群間基因流動，是物種遺傳多樣性水平降低主要原因。高原鼢鼠有獨特的生活方式，主要依靠挖掘地下洞道系統(tǒng)完成活動、取食、擴散等行為。高耗能的挖掘行為嚴重制約其長距離的遷移擴散活動，使擴散率低于地上活動的動物[27]。低的遷移能力使種群間的基因流受到限制，增加種群內(nèi)部近親繁殖的可能，最終使種群遺傳多樣性降低，產(chǎn)生明顯的種群遺傳結(jié)構(gòu)模式[28-30]。

對種群遺傳研究發(fā)現(xiàn)種群的遺傳隔離會有潛在的種的分化，嚴重的限制性基因流會導(dǎo)致種群分化[31]。高原鼢鼠種群進行遺傳結(jié)構(gòu)推導(dǎo)分析中，在K=2時，lnP(D)和ΔK的值都最大，4個種群被分成2組：MYT種群為一組，MYL、MYR和XNG種群聚在一起為一組。4個種群兩兩之間的FST值都大于0.05。種群MYT和MYL之間的遺傳分化程度較高(0.770)，并且種群之間較小的基因流值(小于1)不能阻止其分化。種群遺傳學(xué)認為空間距離、地理障礙等通常是阻礙基因交流、導(dǎo)致分化的重要因素[32]。XNG與MYR間的遺傳分化程度(0.061)小于XNG與MYL間的(0.120)，并且種群XNG和MYR之間的基因流(0.616)大于XNG和MYL之間的(0.313)。MYL和MYR之間的距離不到200 m，中間有河流隔離。XNG與MYT 間的遺傳分化程度(0.339)大于XNG與MYR間的(0.061)，XNG與MYT樣地間存在公路。表明在試驗范圍內(nèi)特殊島狀棲息地限制了高原鼢鼠種群基因流，河流和公路對種群內(nèi)和種群間個體交流可能有阻礙作用。蔡振媛等[12]研究發(fā)現(xiàn)種群間遺傳分化中大約79.6%的變異可以由地理隔離解釋。唐利洲等[11]研究結(jié)果表明高原鼢鼠不同地理種群間存在嚴重限制性基因流。國外其他地下嚙齒動物的研究結(jié)果表明地理距離是造成種群遺傳分化的主要原因[33]，并且在整個種群擴散過程中河流、裂谷、火山對其有阻礙作用[34-36]。除了MYL種群，MYT種群的多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)、期望雜合度都比其他2個種群的要低。島狀地理環(huán)境限制該種群與外界的交流，增加種群內(nèi)部的個體交流的機會，長久積累不利于增加種群遺傳多樣性，進而減弱對環(huán)境變化的適應(yīng)能力[37]。

從遺傳學(xué)的角度分析高原鼢鼠遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)特征及影響因素，種群遺傳多樣性處于中等水平，河流和公路對種群基因交流可能有阻礙作用。對高原鼢鼠來說，長期的特殊生存環(huán)境對整個種群的遺傳特征有較大影響，不利于適應(yīng)新的棲息環(huán)境。高原鼢鼠作為草原害鼠，嚴重破壞草地植被，控制其種群數(shù)量是草原保護工作的主要內(nèi)容之一。由于高原鼢鼠對新環(huán)境的適應(yīng)能力較差，可通過改變其棲息地環(huán)境達到減少種群數(shù)量的目的，有利于草地生態(tài)系統(tǒng)健康持續(xù)發(fā)展。

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