趙海梅, 鹿秀云, 岳海洋, 劉 億, 劉雪珂, 黃小英, 劉端勇

(江西中醫(yī)藥大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2. 科技學(xué)院、3. 研究生院、4. 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

Janus活化激酶 (Janus activated kinase, JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcriptions, STAT) 途徑介導(dǎo)了炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展[1]。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS) 是黃芪的主要活性成分之一，可有效治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎[2]，但其作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜JAK/STAT信號(hào)表達(dá)有關(guān)尚不清楚。

1 材料

1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康 C57BL/6小鼠40只，♂，體質(zhì)量(20 ± 2) g ，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。隨機(jī)分為 4組，即正常組(Normal)、模型組(TNBS)、黃芪多糖組(TNBS+APS)、美沙拉嗪組(TNBS+Mes)，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2藥物與試劑APS購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司；美沙拉嗪購(gòu)自佳木斯鹿靈制藥有限公司；三硝基苯磺酸 (2, 4, 6 -trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS) 購(gòu)自Sigma公司；JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3抗體均購(gòu)于Abcam公司。

1.3儀器低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(力新儀器)；漩渦混勻器 (德國(guó) IKA公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的制備與給藥[3]造模前禁食12 h，除正常組外，小鼠麻醉后，按100 mg·kg-1TNBS計(jì)算，將其溶入0.15 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇復(fù)合溶液，并注入距肛門(mén)約4 cm 處，倒置小鼠5 min，放回原籠中自然蘇醒。造模24 h后，按體質(zhì)量換算，黃芪多糖200 mg·kg-1灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪150 mg·kg-1灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2動(dòng)物處理與病理學(xué)觀(guān)察d 8，分離結(jié)腸，測(cè)量長(zhǎng)度，觀(guān)察腸黏膜損傷程度，稱(chēng)量。準(zhǔn)備病理切片，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并評(píng)分。

2.3Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白分子表達(dá)制備結(jié)腸組織勻漿，測(cè)蛋白含量。電泳后電轉(zhuǎn)PVDF膜上，加JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3、GAPDH一抗，4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h后，曝光顯影，進(jìn)行條帶灰度值的分析。

3 結(jié)果

3.1結(jié)腸長(zhǎng)度、重量及病理?yè)p傷程度評(píng)測(cè)如Tab 1所示，與模型組相比較，APS組結(jié)腸長(zhǎng)度無(wú)明顯縮短(P<0.01)，腸重、結(jié)腸重量指數(shù)及病理?yè)p傷評(píng)分明顯下降(P<0.05或P<0.01)。同時(shí)病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察可見(jiàn)，經(jīng)APS和美沙拉嗪治療后，結(jié)腸黏膜相對(duì)完整，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯潰瘍形成。

Tab 1 Therapeutic effect of APS treated colitis mice

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsTNBS model

3.2APS能調(diào)控結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜JAK/STAT信號(hào)表達(dá)與模型組相比較，APS給藥后，結(jié)腸黏膜p-JAK2和p-STAT6表達(dá)明顯下降，且p-JAK2/JAK2和p-STAT6/STAT6比值也明顯下降(P<0.05或P<0.01)，而SOCS1和SOCS3的表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APS可明顯降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)，恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度，緩解結(jié)腸黏膜病理性損傷，提示APS可有效治療TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)APS治療后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜JAK2和STAT6蛋白磷酸化表達(dá)明顯下降，而SOCS1和SOCS3的表達(dá)明顯升高，提示APS有效治療小鼠結(jié)腸炎可能是通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)活化實(shí)現(xiàn)的。

JAK/STAT途徑廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程[1]，其負(fù)性調(diào)控與SOCS正相關(guān)，該信號(hào)可通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)控Th1/Th2和Th17/Treg型細(xì)胞因子間平衡。如樹(shù)突狀細(xì)胞可通過(guò)JAK/STAT高度表達(dá)IL-12而誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞產(chǎn)生；JAK/STAT被抑制，則IL-12、IFN-γ和 IL-23產(chǎn)生減少，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞增加[4]?；駾Cs激活STAT3，增加IL-10和TGF-β表達(dá)，最終誘導(dǎo)Treg增殖[5]。Th1/Th2和Th17/Treg型細(xì)胞因子間平衡及其細(xì)胞因子在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。我們前期研究基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，APS有效治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的同時(shí)，腸黏膜組織Treg細(xì)胞水平升高，且IL-2、IL-6、IL-17、IL-23下調(diào)，TGF-β1 和 STAT5a水平升高，提示APS有效治療UC可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Treg/Th17間平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)[6]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，APS給藥治療后，小鼠結(jié)腸黏膜中JAK/STAT信號(hào)活化明顯抑制，而SOCS1和SOCS3的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明APS可能通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)活化達(dá)到治療目的。我們預(yù)測(cè)其可能和APS通過(guò)該途徑調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和活化有關(guān)，需要進(jìn)一步研究，此將有助于全面揭示APS調(diào)節(jié)免疫治療結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

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