吳夢瑤，趙洪慶，楊 琴，柳 卓，杜 青，孟 盼，韓遠山，王宇紅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

焦慮性抑郁癥是一種重性抑郁與焦慮共病的復(fù)合型精神障礙疾病，具有精神運動遲滯、致殘率及自殺率高、社會功能損害重、預(yù)后差等特征[1]。大量研究表明，焦慮與抑郁的發(fā)病機制均涉及到神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)[2]、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic- pituitary- adrena，HPA)軸紊亂、神經(jīng)營養(yǎng)缺乏等[3]，然而，焦慮性抑郁疾病的發(fā)病機制研究進展緩慢。本課題組前期已建立焦慮性抑郁大鼠模型[4]，但考慮到該復(fù)合型疾病的特殊性以及嚙齒類動物與人類親緣關(guān)系的疏遠性，采用常規(guī)的嚙齒類動物并不能完全滿足該疾病的研究，建立一種更能模擬焦慮性抑郁臨床發(fā)病特點的合適模型對該病的防治尤為重要[5]。

因此，本實驗擬采用近靈長類動物樹鼩[6]為研究對象，通過慢性皮質(zhì)酮注射建立焦慮性抑郁樹鼩模型，研究焦慮性抑郁模型樹鼩血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、皮質(zhì)醇(cortisol，COR)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)及海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)的單胺遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)含量的表達情況，并采用臨床治療該疾病的一線用藥文拉法辛對模型樹鼩進行干預(yù)，進行藥物預(yù)見性研究，確定模型的可行性，為該病的臨床防治及抗焦慮性抑郁新藥的研發(fā)提供有力的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物CL級中緬樹鼩12只，♂，體質(zhì)量130～150 g，購自云南昆明樹鼩種質(zhì)資源中心，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心[SYXK(湘)2015-0003]。飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)，室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5) %、光/暗周期12 h/12 h，按實驗動物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2試劑與儀器CRH、ACTH、CORT試劑盒(美國R&D 公司)；文拉法辛緩釋片(成都康弘藥業(yè))；皮質(zhì)酮(北京索萊寶生物公司)；5-HT、NE、DA對照品(中國藥品生物制品檢定所)。Morris 水迷宮(北京智鼠多寶生物科技公司)；動物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)(法國Viewpoint公司)；MK-3 型酶標儀(美國Thermo Scientific 公司)；全自動勻漿機(德國IKA 公司)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；SDC電化學(xué)檢測器(荷蘭Antec公司)。

1.3造模及分組12只樹鼩隨機分為3組：正常組、模型組、文拉法辛組，每組4只。正常組樹鼩正常飼養(yǎng)；根據(jù)文獻報道的樹鼩對大鼠體表換算系數(shù)[7]，模型組樹鼩每天給予皮質(zhì)酮皮下注射(27 mg·kg-1)，持續(xù)21 d；文拉法辛組樹鼩于造模同時灌胃給予藥物文拉法辛(6 mg·kg-1，21 d)，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，造模完成后，進行行為學(xué)測試。測試完成后，將動物麻醉，腹主動脈取血，于冷凍臺上分離出大腦海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)、丘腦等組織，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4行為學(xué)檢測

1.4.1自主活動評分 造模結(jié)束后，分析樹鼩的自主活動能力，時間為5 min。自主活動評分包括移動(水平方向的位移)和跳躍(垂直方向的位移)，將兩者次數(shù)相加表示各組樹鼩的相對活動能力。

1.4.2糖水偏好測試 各組樹鼩禁水12 h后，每籠放置2個水盒，一個裝100 mL 蔗糖水(0.029 mol·L-1)，另一個裝等量的蒸餾水，測定樹鼩在6 h(9 ∶00～15 ∶00)內(nèi)分別攝入蔗糖水和蒸餾水的體積，并計算糖水偏好率(糖水消耗體積/總消耗體積×100%)。

1.4.3Morris水迷宮實驗 水槽平均劃分為A、B、C、D 4個象限，用奶粉將水調(diào)成乳白色，將平臺置于水面下2 cm，使其在實驗光線下對樹鼩不可見。于實驗d 17開始對樹鼩進行適應(yīng)性訓(xùn)練，即從平臺象限的正對面將樹鼩面向池壁放入水中，若75 s內(nèi)未找到平臺，則將其牽引至平臺處停留10 s，每天訓(xùn)練1 次，持續(xù)4 d[8]。每次訓(xùn)練結(jié)束后，迅速用毛巾將樹鼩毛發(fā)擦干，以防止樹鼩低體溫。

定位航行實驗：訓(xùn)練完成后，將樹鼩從訓(xùn)練位置面向池壁放入水中，觀察并記錄樹鼩爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)，考察其學(xué)習(xí)能力。

探索實驗：于實驗d 21撤除平臺，由同一入水點將樹鼩面向池壁放入水中，記錄1 min 內(nèi)樹鼩在平臺所在象限的停留時間(stay time，ST)，考察其記憶能力。

1.5HPA軸指標含量測定行為學(xué)測試完成后，用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)將動物麻醉，腹主動脈取血，收集于肝素鈉管中，3 000 r·min-1離心15 min，取血漿，-80℃保存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測各組樹鼩血漿CRH、ACTH、COR的含量。

1.6單胺遞質(zhì)含量測定

1.6.1腦組織勻漿樣本制備 取冷凍保存的海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)，精密稱重，按1 ∶3 比例(杏仁核為1 ∶10)分別加入0.01 mol·L-1高氯酸溶液(內(nèi)含0.03 mmol·L-1EDTA，10 μg·L-1內(nèi)標DHBA)，于冰上進行勻漿，勻漿后4℃、13 000 r·min-1離心10 min ，取上清，用0.22 μm針頭過濾器過濾后進樣。

1.6.2色譜條件 色譜柱：Quattro 3 C18柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm)；流動相：含90 mmol·L-1單水磷酸二氫鈉、50 mmol·L-1單水檸檬酸、1.7 mmol·L-1辛烷磺酸鈉、50 mol·L-1EDTA的混合液-甲醇(87 ∶13)；流速：0.2 mL·min-1; 柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

1.6.3標準曲線繪制 精密稱取適量5-HT、NE、DA對照品，溶于0.01 mol·L-1高氯酸溶液中，配成1 g·L-1混合儲備液。取適量體積的儲備液稀釋成5個梯度濃度點，從低到高依次為3.125、6.25、12.5、25、50 μg·L-1，將標準品溶液由低濃度至高濃度進樣，進樣體積20 μL，對色譜峰進行積分，記錄峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線(Fig 1)。

Fig 1 The standard curve of monoamine neurotransmitters

2 結(jié)果

2.1自主活動評分正常組樹鼩非常活躍，在籠內(nèi)不停上下翻轉(zhuǎn)或水平移動；模型組活動能力下降，跳躍次數(shù)明顯減少，總評分明顯低于正常組(P<0.01)；給予藥物文拉法辛干預(yù)后，樹鼩的活動能力明顯提高(P<0.01)，見Fig 2。

Fig 2 The independent activity score of tree shrews in each group (±s, n=4)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel.

2.2糖水偏好實驗結(jié)果如Fig 3所示，正常組樹鼩對蔗糖水的喜好度明顯高于普通蒸餾水。與正常組相比，模型組糖水偏好率明顯下降(P<0.01)；給予藥物文拉法辛干預(yù)后，糖水偏好率明顯增加(P<0.05)。

Fig 3 Sugar preference rate of tree shrews in each group (±s, n=4)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

2.3Morris水迷宮測試結(jié)果如Fig 4所示，正常組樹鼩逃避潛伏期時間(EL)最短，目標象限停留時間(ST)最長，說明正常組學(xué)習(xí)記憶能力均正常；模型組樹鼩EL值明顯上升(P<0.01)，ST值下降(P<0.05)，學(xué)習(xí)記憶能力較正常組均明顯下降；給予文拉法辛干預(yù)后，EL值下降(P<0.01)，學(xué)習(xí)能力提高，同時ST值增加，記憶能力改善，但無明顯差異。

Fig 4 Comparison of learning and memory ability of tree shrews in each group (±s, n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

2.4血漿CRH、ACTH、COR含量測定結(jié)果如Fig 5所示，與正常組相比，模型組樹鼩血漿CRH、ACTH、COR 含量均明顯升高(P<0.05 或P<0.01)；與模型組相比，文拉法辛組樹鼩血漿CRH、COR 含量明顯降低(P<0.05)，ACTH 含量則無明顯變化。

Fig 5 Contents of CRH, ACTH and COR in plasma of tree shrews in each group(±s，n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.5各腦區(qū)單胺遞質(zhì)含量測定結(jié)果如Fig 6所示，與正常組相比，模型組樹鼩海馬、前額葉皮質(zhì)5-HT、NE、DA 含量均明顯降低(P<0.05 或P<0.01)；杏仁核5-HT、NE、DA 含量均下降，其中5-HT、DA下降值有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，文拉法辛組樹鼩海馬5-HT、NE、DA 含量均明顯升高(P<0.05)；前額葉皮質(zhì)、杏仁核各遞質(zhì)含量均呈上升趨勢，其中前額葉皮質(zhì)5-HT 和NE 含量明顯升高(P<0.05)，杏仁核5-HT 含量明顯上升(P<0.05)。

Fig 6 Contents of monoamine neurotransmitters in different brain regions of tree shrew in each group(±s, n=4)

A：Hippocampus; B：Amygdala; C：Prefrontal cortex.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

3 討論

焦慮性抑郁較單純的焦慮或抑郁更為復(fù)雜，本課題組前期開展了焦慮性抑郁疾病模型的相關(guān)研究，以嚙齒類動物建立了焦慮性抑郁動物模型。而嚙齒類與人類之間存在極大的種屬差異, 因而需要建立非人靈長類動物模型進行補充。靈長類動物在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類更近似，用其進行焦慮性抑郁動物模型的建立，更能模擬該病的臨床發(fā)病特點，是評價該疾病預(yù)防與治療效果最有力的工具[9]。

樹鼩是一種分布于我國西南地區(qū)的小型哺乳類動物，基因組研究表明，樹鼩屬于靈長類或是與靈長類親緣關(guān)系最密切的種屬，腦體質(zhì)量比高，具有較為發(fā)達的神經(jīng)系統(tǒng)和與人類相似的應(yīng)激系統(tǒng)[10]，因此，相比其他非靈長類動物模型有不可替代的優(yōu)勢。文拉法辛是治療各類抑郁癥(包括伴有焦慮的抑郁癥)及廣泛性焦慮癥的臨床一線用藥，因此，本實驗選擇文拉法辛作為驗證焦慮性抑郁動物模型藥物預(yù)見性的實驗用藥。

本研究中，模型組樹鼩自主活動評分明顯下降，符合焦慮性抑郁患者不愛活動的疾病特點。同時，焦慮性抑郁模型樹鼩對糖水的快感缺失、學(xué)習(xí)與記憶能力均下降，與患者的臨床表現(xiàn)類似，在給予藥物治療后，模型樹鼩的行為表現(xiàn)均好轉(zhuǎn)。綜合行為學(xué)測試結(jié)果，說明本實驗焦慮性抑郁樹鼩模型建立成功。

持續(xù)的HPA軸亢進和腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)是焦慮性抑郁疾病的重要發(fā)病機制之一[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組樹鼩存在一定的HPA軸高亢現(xiàn)象，在給予文拉法辛干預(yù)后，模型樹鼩的HPA軸高亢現(xiàn)象能得到一定的緩解。此外，本實驗對動物多個腦區(qū)在焦慮性抑郁狀態(tài)下的單胺遞質(zhì)含量變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)各腦區(qū)單胺遞質(zhì)含量均呈現(xiàn)明顯的下降，說明該疾病下腦內(nèi)單胺遞質(zhì)嚴重失調(diào)，可能是多個腦區(qū)協(xié)同發(fā)生的。文拉法辛作為5-HT和NE的再攝取抑制劑，能通過提高腦內(nèi)5-HT和NE濃度而發(fā)揮雙重抗抑郁作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，文拉法辛對模型樹鼩各個腦區(qū)的5-HT、NE、DA含量均有一定的改善作用，其中對5-HT濃度的改變最為明顯，與文獻報道相符[13]。以上結(jié)果說明，文拉法辛能夠逆轉(zhuǎn)模型樹鼩體內(nèi)的HPA軸高亢以及腦區(qū)單胺遞質(zhì)失調(diào)等病理現(xiàn)象，由此可見慢性皮質(zhì)酮注射誘導(dǎo)的焦慮性抑郁樹鼩模型具有藥物預(yù)見性，是模擬焦慮性抑郁臨床發(fā)病特點的合適模型。

綜上，本實驗以樹鼩為研究對象，采用慢性皮質(zhì)酮注射的方法，建立了一種更接近人類臨床的新型焦慮性抑郁動物模型，通過從動物行為、神經(jīng)內(nèi)分泌等角度綜合評價，并進行藥物預(yù)見性研究，證明該模型是一種成功的、能模擬人類疾病的焦慮性抑郁動物模型。

(致謝：本實驗主要在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體與創(chuàng)新藥物國家重點實驗室培育基地完成，在此對實驗室各位老師及同學(xué)的幫助表示衷心的感謝！特別感謝昆明樹鼩種質(zhì)資源中心提供的實驗樹鼩及其飼養(yǎng)、衛(wèi)生管理、實驗技術(shù)等！)

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