黃漠然，趙文靖，梁耀月，張加余，李晉生，王志斌

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2. 北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，北京 100079；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

心肌缺血損傷是世界上導(dǎo)致突然死亡的主要原因之一。近年來，人們應(yīng)用中藥預(yù)防和治療心肌缺血損傷已顯示出良好的前景[1]。營心丹為北京同仁堂科研人員參考十香返生丹、安宮牛黃丸、再造丸、局方至寶丸、六神丸、冠心蘇合丸、寬胸氣霧劑及日本救心丹組方等歷代名方，根據(jù)中醫(yī)藥理論，治病必求其本、扶正祛邪、標(biāo)本兼顧的方針，以溫開藥物為主，佐使芳香開竅之品而成。前期研究發(fā)現(xiàn)其具有加強(qiáng)心肌收縮力、減慢心率、提高心臟抗缺氧效應(yīng)，并可抑制血小板聚集，增強(qiáng)尿激酶活性，消除血栓形成，對心肌缺血所致的冠心病心絞痛療效確切[2]。

張遠(yuǎn)等[3]實(shí)驗(yàn)表明，靜脈注射營心丹(5 mg·kg-1)對靜脈注射垂體后葉素致家兔心肌缺血模型無明顯改善，但個(gè)別動(dòng)物改善明顯。本研究在此研究背景下，建立舌下靜脈注射垂體后葉素致大鼠心肌缺血模型，采用預(yù)防灌胃給藥，觀察營心丹對心肌缺血的預(yù)防性保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠96 只，♀♂各半，體質(zhì)量(180±20) g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK京2015-0033。

1.2試劑生理鹽水注射液(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1606033202)；4%水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20080902)；肌酸激酶(CK)試劑盒(批號(hào)：20170622)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)試劑盒(批號(hào)：20170527)、糖原磷酸化同工酶BB(glycogen phosphorylase isoenzyme BB，GPBB)試劑盒(批號(hào)：20170601)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)試劑盒(批號(hào)：20170601)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)試劑盒(批號(hào)：20170601)，均購于南京建成生物工程研究所。

1.3藥品硝苯地平(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：F170101)；營心丹(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，批號(hào)：15084127)；垂體后葉素(pituitrin，pit)注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H32026638)。

1.4儀器TE2101-L電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)(中國賽默飛世爾科技有限公司)；Eppendorf AG離心機(jī)(德國Eppendorf)；TW21水浴鍋(德國JULABO)；ZH-2旋渦混合振蕩器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；ECG-9020K心電圖機(jī)(日本光電株式會(huì)社)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與造模SD大鼠96 只，♀♂各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，篩選出60 只肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖正常(麻醉后S點(diǎn)不高于基線)的大鼠，d 6將大鼠隨機(jī)分為6 組：生理鹽水組、模型組、陽性藥硝苯地平組、營心丹高、中、低劑量組，每組10 只。從d 6起，生理鹽水組和模型組灌胃給水1周；陽性藥硝苯地平組灌胃硝苯地平水溶液1周，給藥劑量為12.6 mg·kg-1；營心丹高、中、低劑量組灌胃營心丹高、中、低水溶混懸液1周，給藥劑量分別為25.2、12.6、6.3 mg·kg-1；給藥(水)體積為10 mL·kg-1。最后一次給藥1 h后，舌下靜脈注射pit 1 U·kg-1建立急性心肌缺血模型。舌下靜脈注射pit引起大鼠心肌缺血時(shí)，心電圖ST段的變化可分為2期，第1期注射后5～30 s T波升高，ST段抬高(>0.1 mV)；第2期注射后30 s至數(shù)分鐘，ST段下移，T波降低，平坦，雙向或倒置，心率減慢，P-R及Q-T間期延長，出現(xiàn)第1期或第2期缺血性變化為陽性，否則為陰性[4]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M注射垂體后葉素后30 s前ST段抬高超過0.1 mV，30 s后ST段下移，T波低平或者倒置，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明造模成功。

2.2指標(biāo)檢測

2.2.1心肌缺血大鼠心電圖變化的測定 按10 mL·kg-1腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥固定于鼠板，四肢皮下插入針灸針，連接肢導(dǎo)聯(lián)，記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖；以PP連線為基線，記錄給pit前及注射完pit后0、5、10、15、30 s及1、2、3、4、5、10 min的心電圖ST段值，并比較各組注射pit前后ST段變化。觀察并記錄ECG中室性心律失常發(fā)生率及心肌缺血陽性率。當(dāng)心電圖出現(xiàn)寬大或畸形的QRS波，無P波或P波倒置逆反，心律不齊等一項(xiàng)者記為心律失常。當(dāng)出現(xiàn)下列指征一項(xiàng)者即為心肌缺血陽性：J點(diǎn)升高1.5 mV以上，T波降低50%以上、雙向、倒置，ST 水平升高0.1 mV或下移0.5 mV，心律不齊。

2.2.2心肌缺血大鼠血清生化指標(biāo)的檢測 測定心電圖后，大鼠腹主動(dòng)脈取血6 mL，4℃靜置1 h，以3 500 r·min-1低溫離心10 min，分裝血清于EP管中，-80 ℃保存。測定時(shí)取出血清，快速解凍，嚴(yán)格按照試劑盒說明，測血清中CK、CK-MB、GPBB、cTnI、cTnT的活性或含量。

3 結(jié)果

3.1營心丹對心肌缺血大鼠肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段變化的影響本實(shí)驗(yàn)以注射完pit為0 s，由Tab 1、Fig 1可知，給藥后1 h，生理鹽水組與給藥組差異無顯著性，表明給藥對正常大鼠的心電圖沒有影響。舌下靜脈注射pit后，模型組0 s時(shí) ST段抬高超過0.1 mV，3 min后ST段抬高小于0.1 mV，ST段下移；預(yù)防給藥組0 s時(shí)ST段幾乎無變化，與模型組差異有顯著性(P<0.01)，說明預(yù)防給藥組起效時(shí)間從0 s開始。營心丹高劑量組ST段最大變化量為0.05 mV，營心丹中劑量組ST段最大變化量為0.06 mV，營心丹低劑量組ST段最大變化量為0.09 mV，最大變化量ST高0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。營心丹高劑量組0 s至4 min的ST段變化量與模型組差異有顯著性(P<0.01)，營心丹中劑量組0 s至2 min的ST段變化量與模型組差異有顯著性(P<0.01)，營心丹低劑量組0 s至3 min ST變化量與模型組差異有顯著性(P<0.01 或P<0.05)。

Fig 1 Typical electrocardiogram in each group (horizontal axis 0.02 s·mm-1, vertical axis 0.1 mV·mm-1)

A: NS; B: Model(after pit 5 s); C: Nifedipine(after pit 5 s); D: High dose of Yingxindan(after pit 5 s); E: Medium dose of Yingxindan(after pit 5 s); F: Low dose of Yingxindan(after pit 5 s)

3.2營心丹對大鼠心肌缺血陽性率與心律失常發(fā)生率的影響各給藥組均能降低大鼠舌下靜脈注射pit后心肌缺血陽性率及心律失常發(fā)生率。其中，營心丹高劑量組和硝苯地平組降低心肌缺血陽性率最為明顯，而各給藥組都能明顯降低心律失常率(Tab 2)。

3.3營心丹對心肌缺血大鼠血清生化指標(biāo)的影響

3.3.1對血清中CK、CK-MB的影響 模型組大鼠血清中CK、CK-MB的活性明顯提高，與生理鹽水組比較差異有顯著性(P<0.01)。陽性藥硝苯地平組和營心丹高劑量組血清中CK、CK-MB活性均明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<0.01)；營心丹中劑量組大鼠血清中CK、CK-MB的活性亦明顯降低，與模型組差異有顯著性(P<0.05)；營心丹低劑量組大鼠血清中的CK、CK-MB的活性雖與模型組比較無明顯差異，但是均有一定的降低趨勢。此外，營心丹高、中、低劑量組血清中CK、CK-MB的活性逐漸增大(Tab 3)。

3.3.2對血清中GP-BB的影響 模型組大鼠血清中GP-BB的含量升高，與生理鹽水組相比差異有顯著性(P<0.01)。陽性藥硝苯地平組、營心丹高、中劑量組大鼠血清中GP-BB含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)；營心丹低劑量組大鼠血清中GP-BB含量雖與模型組比較差異無顯著性，但有一定的降低趨勢。此外，營心丹高、中、低劑量組血清中GP-BB的含量逐漸增大(Tab 3)。

3.3.3對血清中cTnI、cTnT的影響 應(yīng)用兩組獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)方法對模型組大鼠血清中cTnI含量分別與其他各組進(jìn)行顯著性差異分析可知，模型組cTnI含量均大于其他各組，與生理鹽水組相比差異有顯著性(P<0.01)，陽性藥硝苯地平組、營心丹高、中劑量組大鼠血清中cTnI含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)；營心丹低劑量組大鼠血清中cTnI的含量與模型組相比無明顯差異，但有一定降低趨勢。營心丹高、中、低劑量組cTnI的含量逐漸增大(Tab 4)。非參數(shù)檢驗(yàn)分析表明，營心丹高、中劑量組間cTnI的含量差異有顯著性(Z=2.53，P<0.01)。硝苯地平組、營心丹高、中、低劑量組大鼠血清中cTnT的含量明顯降低(P<0.01)。且營心丹高、中、低劑量組血清中的cTnT含量逐漸增大(Tab 3)。

Tab 1 Effects of Yingxindan on electrocardiogram ST changes of rats with myocardial ischemia(±s,n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 2 Effects of Yingxindan on positive rate of myocardial ischemia and incidence of arrhythmia of rats(n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 3 Effects of Yingxindan on activity of CK, CK-MB and contents of GP-BB, cTnT in serum of rats(±s，n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 4 Effects of Yingxindan on content of cTnI in serum of rats(n=10)

4 討論

大鼠舌下靜脈注射大劑量pit，可使冠狀動(dòng)脈痙攣[5]、心臟灌流不足、全身小血管收縮，導(dǎo)致血壓升高、心臟后負(fù)荷加重，最終造成心肌缺血缺氧[6]。垂體后葉素所致的心肌缺血損傷是漸進(jìn)性的，其心電圖變化類似于人體急性心肌缺血損傷，并且操作方法簡便，實(shí)驗(yàn)周期短，廣泛用于篩選抗心肌缺血藥物的研究[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制舌下靜脈注射pit致大鼠心肌缺血模型，對營心丹進(jìn)行藥效學(xué)評價(jià)。肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖表明，營心丹可明顯減輕大鼠舌下靜脈注射pit致心肌缺血模型的ST段變化量。營心丹的作用機(jī)制可能通過擴(kuò)張血管，從而降低外周阻力、心臟負(fù)荷、心肌的氧耗，以維持心肌耗氧和供氧的平衡，緩解心肌缺血癥狀。

當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，由于膜的完整性破壞，致通透性增高，細(xì)胞中的CK迅速釋放入血，血清中CK的含量迅速上升。目前認(rèn)為在心肌梗死的診斷中，測定CK的活性比心電圖更可靠，而CK中心肌型同工酶(CK-MB)診斷的特異性最高[8-9]。GPBB是心肌細(xì)胞中含量較高的酶，該酶對心肌缺血缺氧敏感，在心肌損傷早期(小于4 h)即可釋放入血，是急性心肌損傷早期診斷的一項(xiàng)很好的指標(biāo)[10]。靜脈注射pit致心肌缺血模型是急性心肌損傷模型，本實(shí)驗(yàn)劑量的垂體后葉素注射后作用時(shí)間僅僅10 min，不足以引起心肌嚴(yán)重?fù)p傷，而GPBB是心肌損傷早期較靈敏的指標(biāo)，選擇該指標(biāo)可以更加準(zhǔn)確地判斷藥物藥效作用時(shí)段。當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血缺氧等因素遭破壞時(shí)，游離型cTnI和cTnT可首先迅速從細(xì)胞中釋放入血，其時(shí)間和CK-MB相當(dāng)或稍早，但其從肌原纖維上降解的過程持續(xù)時(shí)間很長，可在血中保持較長時(shí)間的升高，故兼有CK-MB升高較早和診斷時(shí)間窗長的優(yōu)點(diǎn)[11]，可作為心臟損傷的指標(biāo)[12]。cTnI和cTnT相比，后者在心肌損傷疾病診斷方面有更高的陽性預(yù)測率[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，營心丹高、中、低劑量均能降低CK、CK-MB、GPBB、cTnI的活性或水平，隨劑量升高而變??；營心丹高、中、低劑量均可明顯降低cTnT的水平，cTnT的含量隨劑量的升高而降低。通過檢測指標(biāo)可知營心丹對心肌損傷早期階段有較好的作用。

綜上所述，營心丹作用機(jī)制可能與改善缺血心肌收縮功能、抗氧化、減輕心肌損傷有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在北京市藥品檢驗(yàn)所藥理毒理科室實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)對實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。)

[1]李 光,邢小燕,張美雙,等.中藥三七對缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及應(yīng)用前景[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(10):1340-4.

[1]LI G, Xing X Y, Zhang M S, et al. Panax notoginseng in treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury and its application prospect[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(10):1340-4.

[2]沙靜妹,毛洪奎. 營心丹[J].中國藥學(xué)雜志,1986,21(11):664-5.

[2]Sha J M, Mao H K. Yingxindan[J].ChinPharmJ,1986,21(11):664-5.

[3]張 遠(yuǎn),樓雅卿,崔萬鈞,等.營心丹的藥理作用研究[J].中成藥研究,1985,(8):25-6.

[3]Zhang Y, Lou Y Q, Cui W J, et al. Study on pharmacological action of Yingxin Dan[J].ChinTraditPatentMed,1985,(8):25-6.

[4]王倩云,宋紅儒,劉向輝,等.圣腦康丸對大鼠急性心肌缺血模型心電圖的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(1):27-9.

[4]Wang Q Y, Song H R, Liu X H, et al. Effect of Shengnaokang pills on electrocardiograms of myocardial ischemia in a rat model[J].PharmJChinPLA,2015,31(1):27-9.

[5]李佳川,劉 朋,劉曉帥,等.桂枝茯苓丸對垂體后葉素致大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,39(3):327-9.

[5]LI J C, Liu P, Liu X S, et al. The protective effect of Guizhi-Fuling pill on pituitrin-induced acute myocardial ischemia in rats[J].JSouthwestUnivrNationalities, 2013,39(3):327-9.

[6]楊 雅,劉 霞. 木補(bǔ)對心肌缺血大鼠ST段及Omentin-1/iNOS和TGF-β1/JNK通路的影響[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,10(1):31-4.

[6]Yang Y, Liu X. The effect of Mubu on ST segment,Omentin-1/iNOS system and TGF-β1/JNK pathway in rats with myocardial ischemia[J].JChengduMedColl,2015,10(1):31-4.

[7]郭玉東,李 麗,左澤平,等. 復(fù)方丹參片對大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2016,32(6):497-501.

[7]Guo Y D, Li L, Zuo Z P, et al. Protective effect of compound Salvia tablets on acute myocardial ischemia in rats[J].PharmJChinPLA, 2016,32(6):497-501.

[8]Zrari S A, Mohammed S K. Diagnostic efficiency of serum creatine kinase and troponin I in patients with suspected acute myocardial infarction[J].TrakiaJSci,2016,14(4):314-9.

[9]Zou L, Su W, Wang M, et al. Characterization of a functional recombinant human creatine kinase-MB isoenzyme prepared by tandem affinity purification from Escherichia coli[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2017,101(14):5639-44.

[10] 魏繼紅,柏金秀,楊小巍,等.糖原磷酸化酶同功酶腦型及心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白在新生兒心肌損害中的應(yīng)用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(22):3711-3.

[10] Wei J H, Bai J X, Yang X W, et al. Application of the glycogen phosphorylase BB and heart-type fatty acid binding protein to the early diagnosis of neonatal myocardial injury[J].JPractMed,2015,31(22):3711-3.

[11] Mythili S, Malathi N. Diagnostic markers of acute myocardial infarction.[J].BiomedRep, 2015,3(6):743-8.

[12] 孫 瑤,張 嬋,簡 潔，等. 九龍?zhí)倏傸S酮調(diào)控自噬對抗心肌缺血/再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31(2):232-6.

[12] Sun Y, Zhang C, Jian J, et al. Effects of Bauhinia championii flavones on adjusting autophagy against myocardial ischemia/reperfusion injury[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(2):232-6.

[13] Solecki K, Dupuy A M, Kuster N, et al. Kinetics of high-sensitivity cardiac troponin T or troponin I compared to creatine kinase in patients with revascularized acute myocardial infarction[J].ClinChemLabMed,2015,53(5):707-14.