劉晶晶，牟艷玲

(1. 濟南大學 山東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2. 山東省醫(yī)學科學院藥物研究所；3. 國家衛(wèi)生部生物技術藥物重點實驗室；4. 山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

近年來，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著我們的健康以及生命。DM若未得到及時的診斷和治療，會引發(fā)多種并發(fā)癥[1]。其中，心血管并發(fā)癥已經成為DM患者發(fā)病率及死亡率的主要危險因素[2-3]，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)則被視為DM獨立的并發(fā)癥。DM高血糖狀態(tài)會促使心血管產生病變，且DCM患者的預后很差，死亡率極高。

研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin經典信號通路對DM的進程起著至關重要的作用，與心臟重構、心肌梗死、心力衰竭、心律失常等病理過程密切相關[4]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)作為Wnt/β-catenin信號通路重要的一個下游信號分子，調控著糖原的合成，GSK-3β的過表達可能刺激胰島素抵抗的產生，與DM的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關系[5]。有研究顯示，在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt/β-catenin信號通路被激活，進一步促進DCM的發(fā)生發(fā)展[6]。另有研究顯示，抑制GSK-3β后，能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的傳導，能夠對DCM的損傷進行修復[7]。故本實驗采用能夠對GSK-3β產生抑制作用的合成藥物甲異靛(meisoindigo，Me)，有文獻報道[8]，其對GSK-3β有抑制作用，已應用于慢性粒細胞白血病中，但對DCM的作用尚未見報道。本文通過檢測Me對Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白表達變化的影響，探討Me在DCM修復過程中的作用機制，為DCM的診斷治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物及模型建立健康♂SD大鼠60只，SPF級，體質量(170±20)g，購自濟南朋悅實驗動物有限公司。大鼠經過1周的適應性喂養(yǎng)期，按體重均衡的原則，隨機分為正常對照組(A)20只，其中4周、8周正常對照組各10只；DM模型組(B)40只。B組大鼠禁食16 h后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg·kg-1，pH=4.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，4℃配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，A組大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。造模后72 h，尾靜脈采血測空腹血糖值(fasting blood glucose, FBG)，以FBG≥ 16.7 mmol·L-1，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和體質量下降者為DM模型成功者。B組造模成功組隨機分為4周DM模型組、4周Me給藥組、8周DM模型組、8周Me給藥組，每組10只。給藥組20 mg·kg-1灌胃給藥，其余組別分別以同體積的蒸餾水灌胃。A、B兩組大鼠均以普通飼料和蒸餾水繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2試劑鏈脲佐菌素、戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；血糖試紙(強生中國醫(yī)療器材有限公司)；生物素標記山羊抗兔IgG/鼠IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Western blot一抗、二抗去除液、裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自碧云天生物技術研究所；ProSieve Color protein markers(美國Lonza Rockland公司)；增強型化學發(fā)光試劑(美國Millipore公司)；單克隆抗體GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、NF-κB p65、β-actin，均購自美國Cell Signaling Technology公司； Wnt2抗體(美國Epitomics公司)；p-NF-κB p65抗體(Ser536，Santa Cruz公司)。

1.3標本收集各周期末，尾靜脈采血測血糖值。大鼠麻醉，仰位固定，開胸，腹主動脈取血，5～10 mL每只，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，分裝到EP管，-20℃保存待測。迅速取出心臟，用預冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿心室壁剪開，剔除血管、脂肪等非心肌組織，分為左心、右心，分別稱取心臟質量(HW)和左心室(含室間隔)質量(LVW)，并計算心臟(左心)指數(shù)=心臟(左心室)質量(mg)/體質量(g)。將左心分為兩部分：一部分用4%多聚甲醛固定，經脫水、透明、包埋，制成心臟組織石蠟塊；另一部分置于凍存EP管，液氮保存待測。

1.4HE染色取正常對照組及各時間點模型組、給藥組心肌組織，制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色10 min，流動的水稍加沖洗，體積分數(shù)1%的的鹽酸乙醇分化，流動水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流動水稍加沖洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片。Eclipse TE 2000-S熒光顯微鏡拍照(日本Nikon)，觀察心肌組織病理結構的變化。

1.5免疫組織化學染色取各組石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌，H2O2溶液封閉30 min，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓3 min，PBS洗滌后與相應一抗4℃濕盒過夜，次日滴加與辣根過氧物標記的二抗，孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精對比染色，自來水洗返藍，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，于免疫熒光顯微鏡下拍照，觀察結果。

1.6Westernblot檢測取各組別大鼠心肌組織，制備組織勻漿，每20 mg組織加入100～200 μL含1 mmol·L-1PMSF的裂解液，4℃下14 000×g離心10 min，取上清，分裝于EP管，-20℃保存。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。40 μg總蛋白上樣量以濃度為10%的凝膠電泳分離。冰浴恒流(300 mA)下濕法轉膜2 h，體積分數(shù)5%的BSA封閉液室溫封閉1 h后，與相應的一抗4℃孵育過夜。TBS-T洗液洗滌，與辣根過氧化物標記的二抗共孵育，增強型化學發(fā)光試劑進行顯色，并用灰度分析軟件定量分析。

2 結果

2.1DM大鼠模型建立情況實驗期間，正常對照組大鼠狀態(tài)良好、健壯、皮毛柔順有光澤，自主活動無異常，對外界反應靈敏，無死亡。與正常對照組大鼠相比，DM模型組大鼠逐漸消瘦，精神萎靡，皮毛黯淡無光澤，腥臊臭味加重等；且隨著時間的增加，多飲、多食、多尿和消瘦加重，生存狀態(tài)越來越差。與DM模型組比較，Me給藥組大鼠體質量稍有增加，精神較DM模型組略好；隨著時間的增加，給藥組大鼠體質量增加明顯，生存狀態(tài)明顯好轉。

2.2大鼠體質量、空腹血糖值及心臟各指標DM模型組大鼠與正常對照組大鼠比較，空腹血糖值明顯升高，體質量明顯下降，心臟和左心室質量明顯降低(P<0.01)。Tab 1顯示，給予大鼠4周Me治療后，相較于正常對照組，Me組空腹血糖值明顯升高，體質量明顯下降，心臟和左心室質量明顯降低，心臟指數(shù)及左心指數(shù)升高，大鼠的身體狀況并沒有向好的趨勢發(fā)展。由此可見，4周Me給藥組相對于DM模型組，療效并不是很明顯，并出現(xiàn)了輕微惡化現(xiàn)象。但隨著時間的延長，給藥至8周時，Me給藥組的體質量、血糖值、心臟指數(shù)及左心指數(shù)較之DM模型組都有了明顯好轉(P<0.05)。見Tab 1、2。

Tab 1 The general characteristics of 4 weeks rats(±s，n=10)

BW: Body weight; FBG: Fast blood glucose; HW: Heart weight; LVW: Left ventricular weight.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM

Tab 2 The general characteristics of 8 weeks rats(±s，n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDM

2.3大鼠心肌HE染色結果如Fig 1所示，正常對照組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊，細胞核分布均勻，無變形、壞死等變化。DM模型組大鼠心肌細胞中能看到不同程度的病變，心肌細胞明顯增大，胞質豐富，排列紊亂，細胞核由正常的圓形或橢圓變?yōu)殚L桿狀，且大小不規(guī)則，尤其是8周DM模型組的大鼠，局部心肌細胞凝固性壞死，胞質嗜酸性增強，核固縮深染，纖維組織增生，壞死灶內淋巴細胞大量增生。較之DM模型組，Me給藥組心肌組織中則偶見心肌細胞點灶狀炎癥浸潤壞死灶，有不同程度的心肌肥大、心肌纖維化等病變緩解的癥狀。

2.4大鼠心肌組織免疫組化結果如Fig 2所示，DM模型組中GSK-3β蛋白在心肌中的表達要比正常對照組中略多，顏色較深，尤其是棕黃色的區(qū)域，則是表現(xiàn)為蛋白的陽性表達范圍，隨著時間的延長，8周時DM模型組的陽性表達更為明顯；而Me給藥組的GSK-3β蛋白陽性表達則比DM模型組的要稍少，細胞質、細胞核均有表達。p-GSK-3β、β-catenin蛋白在DM模型組中的表達，比正常對照組要多，8周DM模型組中p-GSK-3β蛋白表達棕黃色區(qū)域更多，陽性表達更加明顯；與DM模型組相比，Me給藥組中p-GSK-3β蛋白的表達相應減少。NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白在DM組中除了有棕黃色陽性表達現(xiàn)象，還出現(xiàn)有染色較深的區(qū)域，主要為細胞核表達陽性較正常對照組的表達水平有所增加，在Me給藥組中，NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白的細胞核表達則有不同程度的減少，細胞質、細胞核表達均勻。

2.5Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白在大鼠心肌中的表達Western blot 結果表明(Fig 3)，DM模型組大鼠心肌中GSK-3β以及p-GSK-3β蛋白的表達變化相對于正常對照組以及Me給藥組，差異均無顯著性(P>0.05)，然而DM模型組p-GSK-3β/GSK-3β的值相對于正常組明顯升高(P<0.05)，且Me給藥組明顯降低(P<0.05)；DM模型組大鼠從4周到8周期間，Wnt2、β-catenin蛋白的表達水平與正常對照組比較明顯升高(P<0.05)，Me給藥至8周時，Wnt2、β-catenin蛋白表達較正常對照組也有明顯下降(P<0.01)；NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白在4周DM模型組大鼠心肌中明顯升高(P<0.01)，隨著時間的延長，到8周時，NF-κB-p65蛋白的表達在Me給藥組中較DM模型組明顯減少(P<0.01)；p-NF-κB-p65蛋白在DM模型組中的表達與正常對照組相比明顯上升(P<0.01)，Me給藥組中p-NF-κB-p65的表達較DM模型組大鼠明顯下降(P<0.01)。

3 討論

DM可引起機體多個臟器的損害，其中心肌損傷是1型DM常見的并發(fā)癥之一。GSK-3是進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種細胞及生物體內都有表達。在哺乳動物中，GSK-3來自兩個緊密相關的由不同的基因編碼的亞型GSK-3α、GSK-3β，其中以GSK-3β的作用為主[9]。GSK-3β是調控血糖穩(wěn)態(tài)的重要分子，參與許多DM發(fā)生發(fā)展的細胞進程，對心肌肥大也有一定影響，抑制GSK-3β能夠緩解DM大鼠心肌肥大和心衰的癥狀[10]。Wnt/β-catenin經典信號通路在DM中的作用研究也越來越廣泛。研究發(fā)現(xiàn)[11]，Wnt/β-catenin通路在1型型糖尿病心肌病大鼠心肌組織中，處于被激活狀態(tài)，表明Wnt/β-catenin信號通路的激活對糖尿病大鼠心肌損傷起著重要作用。

本實驗采用1次性腹腔注射鏈脲佐菌素的建模方法[1]，建立1型糖尿病大鼠模型，與正常對照組比較，DM模型組大鼠空腹血糖值明顯升高，并呈現(xiàn)持續(xù)的高血糖，體質量明顯低于正常對照組，心肌組織中局部心肌細胞凝固性壞死，胞質嗜酸性增強，壞死灶內淋巴細胞大量增生；與DM模型組相比，4周Me給藥組，心臟指數(shù)、左心指數(shù)各項指標都有一定程度的惡化，可能是由于對早期DM模型大鼠給藥后，上調了大鼠體內p21蛋白的表達，而p21蛋白表達的升高能夠使大鼠體內p65蛋白表達略有上升，使Me給藥組大鼠體內Wnt通路愈發(fā)處于激活的狀態(tài)，從而使DM模型組大鼠各項生命指征沒有好轉的現(xiàn)象[12-13]；而給藥至8周，DM大鼠的各項指征比DM模型組都有了好轉的跡象，HE染色顯示其心肌組織中則偶見心肌細胞點灶狀炎癥浸潤壞死灶，有不同程度的心肌肥大、心肌纖維化等病變緩解的癥狀，表明Me對DM大鼠作用一定時間后，能夠通過抑制GSK-3β的表達，抑制Wnt信號通路的傳導，對DM大鼠的心肌損傷具有一定的緩解作用。

Fig 1 HE staining of myocardium of DM rats(×400)A：Control group; B：4 wk DM; C：4 wk Me; D：8 wk DM; E：8 wk Me

Fig 3 The protein levels of GSK-3β, p-GSK-3β, Wnt2, β-catenin, NF-κB-p65, p-NF-κB-p65 in total protein extracts of myocardium from DM rats analyzed by Western blot(±s，n=10)

A: Representative Western blot analysis of the time-dependent changes of protein levels; B: Bar graph of quantification of protein levels(fold of intensity of bands with β-actin).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vs4 wk DM group

GSK-3β可調控NF-κB、JNK、MAPK等多條信號通路，對DCM的病理生理過程產生影響。有研究顯示[14]，對GSK-3β進行抑制，早期能夠激活Wnt信號通路，增加β-catenin的表達水平，同時還能夠影響NF-κB通路的轉導，但β-catenin的表達的升高與NF-κB通路信號的轉導之間可能是獨立起作用的。另有研究報道[15]，有的抑制劑產生抑制GSK-3β的作用，通過抑制GSK-3β的磷酸化，從而抑制β-catenin的表達水平，繼而抑制Wnt信號通路的激活及信號轉導。本研究Western blot結果表明，Me給藥組大鼠體內GSK-3β蛋白總量變化不大，而p-GSK-3β/GSK-3β的值相對于正常組明顯升高，說明甲異靛該藥對GSK-3β總量及其磷酸化影響不大，而是通過對GSK-3β進行抑制，達到抑制效果的。Western blot結果中，4周和8周DM模型組大鼠心肌中的Wnt2、β-catenin蛋白表達均有升高，特別是到8周時，免疫組化結果也表現(xiàn)為細胞核表達增加，說明Wnt/β-catenin信號通路被激活。而Me給藥組4周時，GSK-3β、Wnt2、β-catenin的表達略有升高，這可能是Me對GSK-3β進行抑制之后，在早期會使其內源性抑制劑增加，能夠產生激活Wnt信號通路的作用，而隨著時間的增加，給藥至8周時，這些蛋白的表達明顯降低，免疫組化結果顯示，細胞核表達減少，細胞核及細胞質表達均勻，表明Wnt/β-catenin信號轉導的減少，信號通路受到抑制。對于GSK-3β作用的下游因子NF-κB-p65、p-NF-κB-p65的表達，在4周、8周DM大鼠心肌中表達升高，而在給藥組中則明顯減少，提示Me對GSK-3β抑制后，能夠對NF-κB信號通路也產生影響，主要是通過減少NF-κB-p65蛋白的磷酸化以及減少DM大鼠心肌中NF-κB-p65的總量得以實現(xiàn)。而Wnt/β-catenin及NF-κB兩條通路之間是如何在DM大鼠發(fā)生發(fā)展過程中產生作用的，還有待進一步實驗研究。

DCM是DM心血管并發(fā)癥的主要組成部分，明確其發(fā)生發(fā)展過程中心肌相關指標的變化，對其盡早診斷治療有重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)Me抑制大鼠體內的GSK-3β蛋白的表達，繼而對Wnt/β-catenin信號通路進行抑制，并下調其下游相關蛋白因子的表達，參與了DM大鼠心肌損傷的修復過程，揭示了Wnt/β-catenin通路的激活以及NF-κB表達的升高均對DM的發(fā)生發(fā)展起著至關重要的作用，該結果將為DCM的早期診斷及治療提供理論依據。

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