馬艷霞，吳勉華，姜澤群，趙鳳鳴，李 黎，李沐涵，陸兔林，杭愛武

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室、2. 第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教研室、3. 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)教研室、4. 藥學(xué)院中藥炮制學(xué)教研室，江蘇 南京 210023)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.) 的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山茱萸具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化等作用[2]。環(huán)烯醚萜苷類成分是山茱萸中的主要成分之一，在糖尿病降血糖、免疫抑制、抗炎等方面發(fā)揮藥理作用[3-4]，但其在急性肝損傷方面的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)對(duì)急性肝損傷細(xì)胞模型的作用，為山茱萸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的肝損傷模型中，主要是TNF-α為主的炎癥因子的過量釋放，引發(fā)一些列的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活某些凋亡通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞程序性死亡，最終發(fā)生肝衰竭[5]。Jesephs等[6]研究證明，在D-半乳糖胺(D-galactosamine, D-GalN)/LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型中，TNF-α介導(dǎo)的受體通路主導(dǎo)了模型小鼠的肝臟細(xì)胞凋亡，由此可以證明，TNF-α在D-GalN/LPS模型中占有重要地位。因此，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的體外肝細(xì)胞損傷模型，為了避免通過LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α的不穩(wěn)定以及無法定量研究等問題，采用D-GalN與TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)人源性肝細(xì)胞L-02損傷作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究。

1 材料

1.1細(xì)胞株人源性肝細(xì)胞(編號(hào)BNCC100012 , L-02購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥品與試劑DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone)；MTT (美國(guó)Amresco)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide , DMSO，廣東光華化學(xué)有限公司)； 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)試劑盒(南京建成生物研究所)；兔抗p-PERK、p-eIF-2α、caspase-3 抗體( 美國(guó)Cell Signaling Technology 公司)；β-actin、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(聯(lián)科生物科技技術(shù)有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(碧云天生物有限公司) 。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；CKX-31倒置顯微鏡(日本Olympus公司) 。

2 方法

2.1環(huán)烯醚萜苷的制備采用乙醇加熱回流法，進(jìn)行多次提取。加入80%乙醇加熱回流提取，首次加入料液比為1 ∶12的80%乙醇，提取2 h；第2次加入料液比為1 ∶10的80%乙醇，提取1 h；第3次加入料液比為1 ∶8的80%乙醇，提取1 h。合并3次的提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，至約每1.2 mL藥液含1 g生藥，上大孔樹脂，吸附12 h，用蒸餾水洗脫，洗至Molish反應(yīng)為陰性，棄去水洗脫液；用10%乙醇洗脫，流速為1.8 BV/h(1 mL·min-1)收集醇洗脫液，濃縮噴霧干燥，得CIG粉末。取一定量的CIG粉末，加生理鹽水配制為1 g·L-1的CIG母液。

2.3CIG對(duì)D-GalN/TNF-α損傷肝細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組(44 mg·L-1D-GalN+100 μg·L-1TNF-α)、CIG高、中、低劑量組(100、20、10 mg·L-1)。對(duì)照組即未加任何處理因素，模型組即常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入含有D-GalN/ TNF-α的培養(yǎng)液，CIG各組即加入含有不同濃度CIG的培養(yǎng)液作用24 h，然后換成含有D-GalN/ TNF-α的培養(yǎng)液作用12 h。模型組與CIG各劑量組在相同時(shí)間點(diǎn)換成含有D-GalN/ TNF-α的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)。

2.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，按上述實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。時(shí)間結(jié)束后棄掉上清，用胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心棄掉上清，參照AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書，加入所需試劑，渦旋混勻，避光作用15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

2.3.3T-AOC、SOD、MDA含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，按上述實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。時(shí)間結(jié)束后，取每孔細(xì)胞上清液50 μL，按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)T-AOC 、SOD、MDA含量。

2.3.4Ca2+熒光強(qiáng)度檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，按上述實(shí)驗(yàn)方案分組，作用時(shí)間結(jié)束，按照Fluo 4-AM操作說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度。

2.3.5Western blot 檢測(cè)各蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。將各組蛋白與上樣緩沖液混勻，95 ℃～100 ℃煮沸變性，取各組細(xì)胞的總蛋白50 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。按1 ∶1 000濃度稀釋一抗，4 ℃搖床孵育過夜，充分洗滌，將HRP 結(jié)合的二抗按1 ∶5 000濃度室溫?fù)u蕩孵育1 h，充分洗膜，加ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)曝光，重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1D-GalN/TNF-α損傷L-02細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 1所示，作用12、24 h的兩組細(xì)胞比較，隨著D-GalN濃度的依次增加，L-02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也不斷增加，在D-GalN 44 mg·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到36%、39%，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但是，比較2個(gè)時(shí)間段的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的抑制率沒有差異。因此，為了縮短實(shí)驗(yàn)周期，我們選擇TNF-α 100 μg·L-1與D-GalN 44 mg·L-1作為合適的實(shí)驗(yàn)造模濃度。

3.2CIG對(duì)D-GalN/TNF-α損傷L-02細(xì)胞活力的影響Tab 1結(jié)果顯示，D-GalN和TNF-α聯(lián)合作用12 h，對(duì)L-02細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到57.8%，與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.01)。加入CIG 100、20、10 mg·L-1預(yù)保護(hù)的3個(gè)組，肝細(xì)胞L-02的增殖抑制率分別為36.8%、44.1%、49.3%，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)果表明，D-GalN和TNF-α聯(lián)合作用可造成細(xì)胞損傷，CIG 10～100 mg·L-1可以降低這種損傷，且呈濃度依賴性。

Fig 1 Effects of D-GalN/TNF-α on inhibitory

**P<0.01vscontrol group

Tab 1 Effects of CIG on L-02 cell inhibitory rate(±s, n=6)

**P<0.01vs control;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3CIG對(duì)L-02細(xì)胞凋亡率的影響Fig 2結(jié)果表明，與模型組比較，CIG 100、20、10 mg·L-1預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4CIG對(duì)T-AOC、SOD、MDA含量的影響Tab 2結(jié)果表明，CIG預(yù)處理組T-AOC、SOD含量較模型組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，CIG高、中劑量預(yù)處理24 h，MDA活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低濃度處理組MDA含量降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 2 Effects of CIG on content of T-AOC,

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 2 Effects of CIG on L-02 cell apoptosis rate

A: Control group; B: Model group; C: CIG 10 mg·L-1group; D: CIG 20 mg·L-1group; E: CIG 100 mg·L-1group; F: The apoptosis rate of different groups. 1: Early apoptosis; 2: Living cells; 3: Late apoptotic and necrotic cells; 4: Cell debris and loss of cells.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.5CIG對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的影響Fig 3結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核清晰，形態(tài)完整，偶見少量細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯；D-GalN/TNF-α損傷組(模型組)細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯升高，細(xì)胞核固縮，形態(tài)不清晰，細(xì)胞數(shù)目明顯減少；給予CIG高、中、低濃度組，細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，Ca2+熒光強(qiáng)度明顯較模型組降低，且各組之間細(xì)胞形態(tài)差異明顯，藥效呈依次降低趨勢(shì)。

3.6CIG對(duì)L-02細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Western blot結(jié)果顯示，D-GalN/TNF-α損傷肝細(xì)胞中磷酸化PERK和eIF2α、凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIG低、中、高濃度組均可降低相關(guān)蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

Fig 3 Effects of CIG on intracellular Ca2+ content in L-02 cells

A: Control group; B: Model group; C: CIG 10 mg·L-1group; D: CIG 20 mg·L-1group; E: CIG 100 mg·L-1group; F: The Ca2+content of different groups. The blue fluorescence is DAPI stained nuclei, green fluorescence is Ca2+.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig 4 Effects of CIG on expression of three kinds of protein in injured L-02 cells

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

4 討論

線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、死亡受體3條調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)的通路都與Ca2+有關(guān)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。大量的活性氧自由基會(huì)破壞細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，使鈣離子重新分配，引起 caspase凋亡家族的激活[7]。有研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定主要是依靠?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+激活Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，激活Bad蛋白[8]。Fas、TRAILR2、TRAILR1、TNFR1等都屬于死亡受體，又是TNF的受體家族，在D-GalN/TNF-α損傷肝細(xì)胞模型中，肝細(xì)胞局部聚集的TNF-α與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，使凋亡家族caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化，細(xì)胞凋亡反應(yīng)發(fā)生[9]。

肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中最重要的一條就是PERK/eIF-2α-CHOP途徑。PERK屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅰ型膜蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后PERK/eIF-2α-CHOP途經(jīng)被激活，磷酸化的eIF-2α誘導(dǎo)下游的轉(zhuǎn)錄因子ATF4以及下游的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)?；罨腁TF4誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，CHOP的激活是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最重要途經(jīng)[10]，而且PERK/eIF-2α通路是CHOP蛋白表達(dá)所必需的[11]。CHOP被激活后，通過調(diào)節(jié)參與凋亡途徑的蛋白表達(dá)發(fā)揮作用，抑制抗凋亡基因Bcl-2，激活caspase-3和 caspase-9。而caspase-3的表達(dá)并不僅僅是被CHOP而激活，Ca2+、氧化應(yīng)激都導(dǎo)致了caspase家族的激活。因此，降低caspase-3基因的表達(dá)，在抗細(xì)胞凋亡等方面具有重要的意義。

CIG對(duì)D-GalN/TNF-α誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究中，CIG對(duì)于提高損傷細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受力具有積極的影響，可以降低D-GalN/TNF-α損傷導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量升高，減輕因鈣離子濃度過高引起的細(xì)胞器損傷，降低相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，從多方面發(fā)揮對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技能實(shí)驗(yàn)室完成，感謝席蓓麗老師，段煜、李文婷等同學(xué)的幫助，在此致以真誠(chéng)的感謝。)

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