陳 寧，郝 軍，朱桂云，安曉穎，孫精晶，歐陽琴，楊永輝

(1. 河北省胸科醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050041；2. 河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，最終引起終末期腎衰竭(end-stage renal disease, ESRD)[1-2]。目前，針對DN的治療仍以預(yù)防為主，臨床上尚未研發(fā)出治療DN尤其是抗腎間質(zhì)纖維化的有效藥物。因此，研究DN腎間質(zhì)纖維化特別是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積的發(fā)生機(jī)制，并尋找潛在的干預(yù)靶點，將對DN的防治起到關(guān)鍵作用。硫酯酶超家族成員4(thioesterase superfamily member 4, THEM4)是一種Akt內(nèi)源性抑制因子[3]。本研究前期從細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pYr-ads-4-THEM4的轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞phospho-Akt(Ser 473)的活化以及膠原的分泌。然而，過表達(dá)THEM4能否減輕糖尿病小鼠腎臟ECM沉積還有待進(jìn)一步證實。因此，本研究通過尾靜脈注射將pYr-ads-4-THEM4表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至糖尿病小鼠體內(nèi)，進(jìn)一步觀察THEM4在糖尿病小鼠腎臟中的表達(dá)及其對ECM沉積的影響。

1 材料與方法

1.1試劑pYr-ads-4-THEM4 vector、pYr-adshuttle-4 empty vector均購自長沙贏潤生物有限公司；TransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solution購自美國Mirus公司；兔抗THEM4單克隆抗體(14692-1-AP)、兔抗β-actin單克隆抗體(20536-1-AP)、兔抗α-SMA單克隆抗體(14295-1-AP)、兔抗纖維黏連蛋白(fibronectin, FN)單克隆抗體(13548-1-AP)、兔抗Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ, Col Ⅲ)單克隆抗體，均購自美國Protein Tech公司；兔抗phospho-Akt (Ser 473)單克隆抗體(#4060)、兔抗Akt單克隆抗體(#4685)，均購自美國Cell Signaling公司；兔抗TGF-β1單克隆抗體(#AP12348a) 購自ABGENT。

1.2動物模型及分組體質(zhì)量20～25 g健康♂CD1小鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證編號0126327)。將實驗動物隨機(jī)分為正常對照組(Control組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病+THEM4質(zhì)粒組(DM+THEM4)、糖尿病+空質(zhì)粒組(DM+V)，每組10只。后3組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ, 溶于0.1 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5，150 mg·kg-1)，72 h后尾尖取血，血糖≥16.7 mmol·L-1者確定為DM模型。質(zhì)粒注射組小鼠在成模4周后，分別給予尾靜脈快速注射pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒或 pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒(1 mg·kg-1)。此后每隔7 d注射1次，共注射4次。

1.3標(biāo)本收集DM模型建成后，每周測血糖1次，不符合標(biāo)準(zhǔn)者棄去。于質(zhì)粒注射4周后處死小鼠。在處死前1 d于代謝籠中單獨飼養(yǎng)收集24 h尿液，記錄尿量。禁食6～8 h，稱重后異氟烷吸入麻醉，摘眼球取血，離心分離血清，用于測定血糖、血尿素氮和血肌酐；切取腎臟，取部分腎組織置于4%多聚甲醛(0.01 mol·L-1PBS配制)固定，用于免疫組化檢測，部分腎皮質(zhì)組織液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于提取蛋白和RNA。

1.4血尿生化指標(biāo)檢測每個樣本取20 μL血清，采用雷杜RT-9600半自動生化分析儀測定血糖(Glu)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)。同時，每個樣本取20 μL尿液測尿蛋白濃度，計算24 h尿蛋白量 (Upro)。

1.5Real-timePCR檢測THEM4mRNA的表達(dá)嚴(yán)格按照RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒(#DP431)說明書提取腎組織RNA，具體步驟參見文獻(xiàn)[4]。目的基因的引物序列分別為：小鼠THEM4 sense 5′-CCAGGAGCAGCTAGGAGGTTA-3′，antisense 5′-GTCTGAGGTCCTTAGTCCAGC-3′，擴(kuò)增片段91 bp；小鼠GAPDH sense 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，antisense 5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物95 bp。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性 95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照校正，用2-△△Ct法分析基因的相對表達(dá)。

1.6蛋白印跡檢測Akt、phospho-Akt(Ser473)、THEM4、TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)將等量腎組織剪碎后，加入10倍體積的預(yù)冷的組織裂解緩沖液，用玻璃研磨器將組織塊研碎，冰上裂解30 min，低溫高速離心(4℃、12 000 r·min-1、20 min)，上清液即為所提取的蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)試劑法進(jìn)行蛋白定量。每組樣品取50 μg蛋白，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA封閉液37℃封閉1 h，加入抗THEM4、Akt、phospho-Akt(Ser 473)、α-SMA、TGF-β1、β-actin一抗(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h。滴加ECL發(fā)光試劑于膜上，反應(yīng)1 min后，OdysseyFC成像系統(tǒng)顯影。最后用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。

1.7免疫組化檢測THEM4、phospho-Akt(Ser473)、FN和ColⅢ蛋白表達(dá)采用三步法進(jìn)行免疫組化檢測，具體步驟如下：石蠟切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水；0.3% 過氧化氫去離子水室溫孵育以去除內(nèi)源性過氧化物酶；pH 6.0枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行微波修復(fù)；滴加封閉液(10%正常山羊血清)，37℃孵育30 min，減少非特異性染色；滴加一抗[THEM4 1 ∶50, phospho-Akt(Ser 473) 1 ∶200, FN 1 ∶100, Col III 1 ∶100]，4℃過夜；分別滴加生物素

Tab 1 Serum glucose (Glu), 24-hour urine protein (Upro), serum creatinine (Scr) and serum BUN (n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM+V

化羊抗兔/鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈卵白素工作液，37℃孵育30 min。用新鮮配制的DAB-H2O2液顯色，蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)、脫水、透明、封片。免疫組化結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus(IPP)圖文分析軟件分析，每個標(biāo)本切片取10個高倍視野(400倍)，綜合陽性面積和染色深度計算陽性區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density, IOD)，以各組的均值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血、尿生化指標(biāo)檢測同正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及血尿素氮水平分別上調(diào)了4.96、2.59、1.52、7.50倍(P<0.05)，經(jīng)pYr-ads-4- THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，血肌酐、血尿素氮及24 h尿蛋白的水平均明顯降低(P<0.05)， 而pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒組上述指標(biāo)未觀察到明顯變化(Tab 1)。

2.2過表達(dá)THEM4抑制糖尿病小鼠腎臟phospho-Akt(Ser473)的活化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，real-time PCR檢測THEM4 mRNA的表達(dá)，F(xiàn)ig 1結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腎臟THEM4 mRNA的表達(dá)較正常對照組明顯降低，經(jīng)pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)明顯上調(diào)。Fig 2 Western blot結(jié)果顯示，pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟THEM4蛋白的表達(dá)較pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒組上調(diào)了8.84倍。同樣地，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，THEM4蛋白在正常對照組小鼠有一定量的表達(dá)，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后陽性表達(dá)明顯增加。IPP軟件分析陽性區(qū)域IOD值結(jié)果顯示，與pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒組相比，pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟THEM4蛋白的表達(dá)上調(diào)了9.43倍(Fig 3、Tab 2)。與THEM4蛋白的表達(dá)恰好相反， phospho-Akt (Ser 473)在糖尿病組小鼠腎臟中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而經(jīng)pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)受到明顯抑制，下調(diào)了60.00%。同時免疫組化IPP軟件分析陽性區(qū)域IOD值結(jié)果顯示，THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組phospho-Akt (Ser 473) 的表達(dá)較空質(zhì)粒組下降了54.33% (Fig 4、Tab 2)。而總Akt的表達(dá)在各組間未見明顯差異。

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM+V group

Fig 2 THEM4, phospho-Akt (Ser 473) and Akt protein expressions in renal cortex examined by Western blot

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM+V group

Fig 3 Immunohistochemical staining for THEM4 in kidneys of mice of four groups (Scale bar: 50 μm)

A: Control group; B: DM group; C: DM+ THEM4 group; D: DM+V group. Black arrows show positive signal.

Fig 4 Immunohistochemical staining for phospho-Akt (Ser 473) in kidneys of mice of four groups (Scale bar: 50 μm)

A: Control group; B: DM group; C: DM+ THEM4 group; D: DM+V group. Black arrows show positive signal.

2.3過表達(dá)THEM4抑制糖尿病小鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達(dá)Western blot進(jìn)一步檢測了各組小鼠腎臟α-SMA和TGF-β1蛋白的表達(dá)。Fig 5結(jié)果顯示，糖尿病組小鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達(dá)較正常對照組相比明顯上調(diào)。而通過尾靜脈注射pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染組α-SMA和TGF-β1的表達(dá)與空質(zhì)粒組相比分別下調(diào)了24.37%和76.50%。

Fig 5 Western blot detection and statistical analyses for TGF-β1 and α-SMA

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM+V group

2.4過表達(dá)THEM4抑制糖尿病小鼠腎臟ColⅢ和FN的表達(dá)為了進(jìn)一步觀察過表達(dá)THEM4對糖尿病小鼠腎臟ECM沉積的影響，應(yīng)用免疫組化檢測了各組小鼠腎臟Col Ⅲ、FN的表達(dá)，F(xiàn)ig 6、7結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空質(zhì)粒組及糖尿病組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)二者均出現(xiàn)了明顯的陽性信號，主要定位于近端腎小管上皮細(xì)胞的間質(zhì)內(nèi)，而pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒組小鼠腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)中Col Ⅲ和FN的表達(dá)明顯降低，IPP軟件分析Col Ⅲ及FN陽性區(qū)域IOD值較空質(zhì)粒組相比分別降低了40.43%及51.47%( Tab 2)。

3 討論

目前，減少ECM的過度沉積被認(rèn)為是防治DN尤其是腎小管間質(zhì)纖維化的一個熱點。當(dāng)腎臟受到長期的炎癥介質(zhì)浸潤以及高糖刺激后，會導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞發(fā)生炎癥改變，并激活多種ECM轉(zhuǎn)錄蛋白，從而分泌過量的膠原、FN等ECM成分，最終引起腎臟的損傷[5-7]。因此，減少ECM的積聚是延緩DN發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Tab 2 Expression of THEM4, phospho-Akt (Ser 473), FN and Col Ⅲ protein by immunohistochemistry (±s,n=6, IOD)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM+V

Fig 6 Immunohistochemical staining for Col Ⅲ in kidneys of mice of four groups (Scale bar: 50 μm)

A: Control group; B: DM group; C: DM+ THEM4 group; D: DM+V group. Black arrows show positive signal.

Fig 7 Immunohistochemical staining for FN in kidneys of mice of four groups (Scale bar: 50 μm)

A: Control group; B: DM group; C: DM+ THEM4 group; D: DM+V group. Black arrows show positive signal.

新近研究發(fā)現(xiàn)，G 蛋白偶聯(lián)受體 TGR5能夠抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、FN蛋白的表達(dá)，減輕DN的ECM沉積[8]。大黃素通過抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖、FN 表達(dá)與 p38MAPK活化，發(fā)揮抗糖尿病腎臟纖維化的作用[9]。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)，PTEN(Akt的抑制劑之一)通過抑制Akt的活性，下調(diào)糖尿病小鼠腎臟結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達(dá)及減少ECM積聚[10]。而THEM4作為Akt另一重要的內(nèi)源性抑制因子，該基因是位于1號染色體長臂21-24區(qū)，與糖尿病、慢性腎臟疾病等代謝性疾病發(fā)生相關(guān)的基因[11]，其是否參與了糖尿病腎臟ECM沉積及其影響如何卻尚未見報道。

基因水平的研究是探討疾病發(fā)病機(jī)制的重要手段，通過將外源性基因?qū)塍w外培養(yǎng)的細(xì)胞或者動物模型靶組織中使其過度表達(dá)，或通過基因敲除使其有效沉默，從而探討目的基因在疾病發(fā)病過程中的作用及其可能機(jī)制，為疾病的靶向治療提供方向。有學(xué)者將攜帶脂肪因子adipsin的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-adipsin通過尾靜脈注射導(dǎo)入2型糖尿病大鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能有效改善大鼠的糖、脂質(zhì)代謝紊亂，對糖尿病的防治具有一定效果[12]。李科軍等[13]研究證實，糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞數(shù)量增多并伴隨α-SMA、TGF-β1及FN等蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而通過小鼠尾靜脈注射細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白1(suppressors of cytokine signaling 1, SOCS1)表達(dá)質(zhì)粒后，能明顯降低α-SMA、TGF-β1及FN等蛋白的表達(dá)，減輕糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)纖維化。另外，有學(xué)者通過對糖尿病小鼠尾靜脈注射早期生長反應(yīng)蛋白 1( early growth response protein 1, Egr-1)表達(dá)質(zhì)粒后，可引起系膜細(xì)胞的增殖及系膜區(qū)ECM的積聚；而Egr-1 siRNA質(zhì)粒的尾靜脈注射能有效緩解糖尿病小鼠的上述病變[14]。

本研究同樣通過小鼠尾靜脈注射，將pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至糖尿病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)THEM4 mRNA及蛋白均在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟中高表達(dá)，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果證實過表達(dá)THEM4通過抑制phospho-Akt(Ser 473)的活化以及下調(diào)α-SMA、TGF-β1、Col Ⅲ、FN等蛋白的表達(dá)，減輕糖尿病小鼠ECM的積聚。另外，經(jīng)THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，小鼠血肌酐、血尿素氮以及24 h尿蛋白水平較糖尿病組及空質(zhì)粒組相比均有所下降，提示THEM4的過表達(dá)能夠有效改善DM模型小鼠的腎功能，對糖尿病腎損害有一定的防治意義。

本實驗首次對THEM4在糖尿病小鼠ECM沉積中的影響進(jìn)行了研究，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)使THEM4在糖尿病小鼠體內(nèi)過表達(dá)，并揭示過表達(dá)THEM4能夠減輕糖尿病小鼠腎臟ECM的沉積。通過本研究能夠更加深入地了解糖尿病腎臟ECM沉積的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并為其靶向治療提供新的理論依據(jù)和研究思路。

(致謝：本實驗于河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室完成，感謝實驗室全體老師的幫助。)

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