李 媛，吳 增，靳曉飛，周曉紅，高維娟

(1．承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200)

腦血管疾病是危害中老年人健康的常見疾病之一，它具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)[1]。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，人們對腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病機制有了更深入的探索，在治療腦缺血/再灌注損傷的藥物中，傳統(tǒng)中藥黃芪發(fā)揮了巨大的作用。黃芪屬豆科草本植物，具有補氣固表、斂瘡生肌、活血化瘀、消腫止痛的作用[2]?，F(xiàn)代研究證實，黃芪不僅可以擴張血管、改善腦血流量，且具有清除氧自由基、提高超氧化物歧化酶活性等多重功效[3-4]。目前，國內(nèi)應(yīng)用黃芪與其他藥物配伍治療腦缺血的研究比較常見，而單獨應(yīng)用黃芪的某個單體是一個新的探索。黃芪甲苷作為黃芪皂苷類的單體成分，可抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細胞凋亡[5]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究目的在于探討黃芪甲苷是否具有減輕大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 健康清潔級SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量(260±20) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2016-0011。

1.1.2試劑 氯化2,3,5,三苯基四氮唑(TTC)購自Biosharp公司；甲苯胺藍溶液、水合氯醛購自北京索萊寶生物科技有限公司；大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)線栓購自北京西濃生物科技有限公司；黃芪甲苷購自南京森貝伽生物科技有限公司，每瓶100 mg，純度≥98%，生產(chǎn)批號：170302；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 EG11508型組織包埋機、RM2255型全自動輪轉(zhuǎn)切片機、DM5000B型光學(xué)顯微鏡，均購自德國Leica公司；H-7650型透射電子顯微鏡購自HITACHI公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與造模 SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(Sham)、腦缺血/再灌注組(I/R)、黃芪甲苷組(AS-IV)和溶劑對照組(Vehicle)。采用改良線栓法模擬局灶性腦缺血/再灌注損傷：SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，于術(shù)前12 h禁食、4 h禁水，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定到操作臺上，備皮消毒，采用頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)肌肉組織暴露左側(cè)頸總動脈以及頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎并離斷頸外動脈，選取合適的線栓由頸外動脈殘端進入，經(jīng)頸內(nèi)動脈到達大腦中動脈并阻塞大腦中動脈[6]。缺血2 h后，緩慢輕柔地拔出線栓直至頸外動脈殘端，使頸總、頸內(nèi)動脈血流通暢，即再灌注開始。再灌注24 h后，挑選模型成功的大鼠處死取材[7]。Sham組線栓由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，但不入顱，除插入深度外，余手術(shù)方法與各組相同；AS-IV組于再灌注的同時腹腔注射黃芪甲苷20 mg·kg-1，黃芪甲苷100 mg溶于二甲基亞砜(DMSO)后經(jīng)生理鹽水稀釋配成終濃度為1 g·L-1溶液[8-9]；Vehicle組腹腔注射等量等濃度的DMSO生理鹽水稀釋液。

1.2.2神經(jīng)功能學(xué)評分 術(shù)后24 h進行神經(jīng)功能學(xué)評分。Zea Longa評分標(biāo)準：0分，正常無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。0分、4分或死亡者剔除，1～3分者列為實驗對象。

1.2.3TTC染色測定大鼠腦梗死體積 各組于再灌注24 h后斷頭取腦，取完整的腦組織置于-20℃冰箱內(nèi)，冷凍15 min后行冠狀位切片，每片厚度為2 mm，置于2%的TTC染液中，37℃溫箱避光孵育30 min，每隔15 min翻動1次。傾出染液，PBS終止染色，置于4%多聚甲醛固定2 h后拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件計算腦梗死體積。

1.2.4尼氏染色觀察細胞形態(tài) 取各組大腦中動脈供血區(qū)域的腦組織行冠狀位切片(厚3～4 mm)，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，厚度5μm連續(xù)冠狀切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，浸入甲苯胺藍1%水溶液染色30 min，蒸餾水洗，體積分數(shù)0.95的乙醇分色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu) 取缺血半暗帶部位大小為1 mm×1 mm×1 mm的腦組織數(shù)塊，PBS清洗后迅速放入預(yù)冷的4%戊二醛固定液固定2 h，PBS清洗、1%鋨酸后固定2 h，丙酮溶液梯度脫水，Epon812包埋，恒溫箱聚合。半薄切片選區(qū)后行超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死體積的變化如Fig 1所示，Sham組未見梗死灶，其他各組均有不同程度的梗死灶形成。與I/R組相比，AS-IV組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Vehicle組則無明顯差異(P>0.05)。

Fig 1 Change of infarct volume with different treatment examined by TTC staining(±s, n=6)

A: Photographs of brain sections with TTC staining; 1: Sham; 2: I/R; 3: AS-IV; 4: Vehicle; B: Percentage of infarct volume.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R and vehicle.

2.2各組大鼠神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)變化如Fig 2所示，Sham組可見細胞排列規(guī)整，胞核清晰，尼氏體豐富，染色均勻。I/R組細胞損傷嚴重，細胞排列紊亂，核固縮深染，核膜模糊不清，尼氏體著色較淺。與I/R組相比，AS-IV組細胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，細胞形態(tài)較完整，尼氏體增多，染色較均勻；Vehicle組細胞形態(tài)則無明顯變化。

2.3各組大鼠神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的變化如Fig 3所示，Sham組可見細胞核膜光滑完整，染色質(zhì)均勻，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器結(jié)構(gòu)清晰可辨。I/R組可見細胞核膜斷裂、溶解，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，線粒體腫脹，基質(zhì)密度減低，嵴消失，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成。與I/R組相比，AS-IV組細胞狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，可見細胞核膜較為光滑，染色質(zhì)均勻，線粒體輕度腫脹變圓；Vehicle組則無明顯變化。

Fig 2 Morphological changes of nerve cells in each group (Nissl staining, ×400)

Fig 3 Ultrastructure of cells under transmission electron microscope in each group(×20 0000)

A:Sham; B:I/R; C:AS-IV; D:Vehicle

3 討論

腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的病理生理過程，目前研究認為自由基、細胞內(nèi)鈣離子增多以及白細胞的激活是其重要的發(fā)病環(huán)節(jié)[10]。缺血/再灌注導(dǎo)致自由基增多，自由基的化學(xué)性質(zhì)極為活潑，且氧化作用強，可與細胞膜的骨架成分發(fā)生反應(yīng)，從而造成細胞結(jié)構(gòu)損傷以及功能代謝障礙。本實驗在透射電鏡下觀察到，I/R組細胞膜、核膜斷裂溶解，細胞腫脹，其原因可能是自由基同膜脂質(zhì)不飽和脂肪酸相互作用，引發(fā)了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。膜的流動性降低、通透性升高，細胞膜上Na+-ATP酶、Ca2+-ATP酶及Na+/Ca2+交換系統(tǒng)功能異常，將會使細胞內(nèi)Na+、Ca2+濃度升高，造成細胞腫脹、Ca2+超載。細胞內(nèi)Ca2+的增加可激活磷脂酶類，促使膜磷脂降解[11]，膜結(jié)構(gòu)進一步被破壞。細胞內(nèi)Ca2+的增加也可激活核酶，引起染色體的損傷，在透射電鏡下亦可觀察到細胞核內(nèi)異染色質(zhì)的增多。缺血/再灌注時，白細胞數(shù)量有所增多，以中性粒細胞的增多最為明顯，相較于紅細胞而言，中性粒細胞體積大、變形能力弱，在一些黏附分子的作用下，中性粒細胞能與受損的血管內(nèi)皮細胞緊密結(jié)合，阻塞微血管，促使無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生，加重細胞缺血性損傷[12,16]。

黃芪是一味傳統(tǒng)的補氣圣藥。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有2 000多年的歷史。研究證實，黃芪具有改善微循環(huán)、降低血脂、提高一氧化氮合酶和一氧化氮含量等作用。黃芪甲苷是黃芪三大有效活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理活性[13]，對缺血器官的保護也有明顯的作用[14]。黃芪甲苷可以抑制自由基的生成，減小脂質(zhì)過氧化物的反應(yīng)，影響鈣泵并調(diào)節(jié)Ca2+的轉(zhuǎn)運功能，從而緩解鈣超載引起的細胞損傷[15]。黃芪甲苷亦可以促進內(nèi)皮細胞的增殖與遷移，干預(yù)炎性細胞黏附，改善血管內(nèi)皮細胞[16]，并且促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，促進血管的生成和神經(jīng)功能的恢復(fù)[17]。

本實驗采用線栓法模擬腦缺血/再灌注損傷，應(yīng)用黃芪甲苷分別從腦梗死體積、神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面進行研究，觀察治療效果。結(jié)果顯示，Sham組無梗死現(xiàn)象的發(fā)生，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)清晰完整；I/R組損傷側(cè)出現(xiàn)腦梗死，神經(jīng)細胞排列紊亂、核固縮，透射電鏡下細胞膜、核膜斷裂溶解，核內(nèi)異染色質(zhì)增多；與I/R組相比，AS-IV組腦梗死體積縮小，細胞膜、核膜缺損程度降低，細胞的整體狀態(tài)有所改善。本實驗結(jié)果表明，黃芪甲苷可以減輕大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而，目前黃芪甲苷針對腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用的探究只是一個初步的認識，腦缺血/再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性因子的介入以及蛋白、基因等方面的變化，尚未進行深入的探討。本課題組將繼續(xù)深入研究黃芪甲苷對腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用機制。

(致謝：本實驗在河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助！)

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