冷 雪 ，宋 囡，臧安緣，李其芳，谷麗艷

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110847)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。近年來，心血管疾病呈逐年上升的趨勢(shì)。人參是傳統(tǒng)中藥之一，人參皂苷Re(ginsenoside, Re)為人參的主要活性成分之一。研究表明，人參皂苷Re可增加心肌供氧量，使心率明顯降慢[1-2]，抑制caspase-3表達(dá)[3]，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。由于心肌缺血過程中心肌損傷的發(fā)生是多因素、多途徑的，所以心肌損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的信號(hào)通路是探討防治心肌損傷和細(xì)胞凋亡的有效方法。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，人參皂苷對(duì)大鼠急性心肌缺血的心肌具有一定的保護(hù)作用[4-5]，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。有研究表明，在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血/再灌注時(shí)，Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路激活與心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[6]。因此, 本研究通過復(fù)制大鼠急性心肌缺血損傷模型, 探討人參皂苷Re預(yù)處理對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌凋亡蛋白Bax、Bcl-2與JAK2/STAT3通路的影響，進(jìn)一步探討心肌缺血的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑人參皂苷Re、葛根素(puerarin, PUE)(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)； 異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)(Sigma公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、谷胱甘肽合成酶(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutas, SOD)、丙二醛(malondialdehyd, MDA)測(cè)定試劑盒、SABC試劑盒，均購自基爾頓生物科技(上海)有限公司；Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、生物素化山羊抗小鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)公司)。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組給藥清潔級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180±20)g，由遼寧省本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2013-0009。SD大鼠75只，♀♂不限，隨機(jī)分為5組(n=15)，分別為空白對(duì)照組(control)、模型組(model)、葛根素組(PUE 30 mg·kg-1)、人參皂苷Re高劑量(20 mg·kg-1)組(Re-H)、人參皂苷Re低劑量(10 mg·kg-1)組(Re-L)。各組均腹腔注射給藥(10 mL·kg-1)，空白對(duì)照組、模型組分別給予等量的生理鹽水。連續(xù)給藥6 d，每天1次。開始給藥后的d 5和d 6，除空白對(duì)照組外，其余各組連續(xù)2次皮下多點(diǎn)注射給予ISO(30 mg·kg-1)，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，給藥體積均為10 mL·kg-1。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1心肌表面血流量檢測(cè) 每組末次給藥10 min后，隨機(jī)取5只，10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定，麻醉后5 min，除空白對(duì)照組皮下給予等量生理鹽水外，其余各組均皮下多點(diǎn)注射ISO，用FLPI2-MOOR激光散斑實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)(英國Moor公司)進(jìn)行心臟表面微循環(huán)掃描，記錄注射3 min后心臟表面30 s內(nèi)的心臟血流情況。

1.3.2心肌指標(biāo)LDH、CK、SOD、MDA、GSH含量檢測(cè) 取各組其余的10只大鼠，給藥15 min后，生理鹽水將心肌組織勻漿，制備10%心肌勻漿液，然后按照ELISA試劑盒說明書，分別設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)孔及對(duì)照孔，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出結(jié)果。

1.3.3心肌Bax、Bcl-2免疫組化檢測(cè) 常規(guī)心肌脫蠟入水后，3%過氧化氫除去內(nèi)源性酶20 min,微波修復(fù)10 min,冷卻后按照SABC試劑盒進(jìn)行操作，加5% BSA封閉液,室溫10 min。加1 ∶500大鼠抗Bcl-2、Bax抗體, 4℃過夜;加生物素化山羊抗小鼠IgG, 25℃ 20 min,加SABC,25℃ 20 min。以上每步后均以0.5 mol·L-1PBS沖洗3～4次，DAB顯色,蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片。

1.3.4JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組大鼠心肌組織，稱取100 mg放入玻璃勻漿器中，加入1 mL裂解液，冰上充分研磨；12 000 r·min-1、4℃離心10 min，取上清；BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣20 μL，電泳后轉(zhuǎn)膜3 h，一抗孵育1 h后，4℃ 過夜，次日二抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發(fā)光液后，曝光30 min，掃描圖像后分析結(jié)果，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參 β-actin 條帶的光密度比值，再各組比較。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌平均血流灌注量(pu) 如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌平均血流量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，PUE組和Re-H可明顯提高心肌平均血流量(P<0.05)，Re-L組也有增高趨勢(shì)，但小于PUE和Re-H組(P<0.05)。

2.2各組大鼠心肌CK、LDH、MDA、SOD、GSH含量變化Tab 1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠CK、LDH、MDA含量均增多(P<0.05)，SOD、GSH含量降低(P<0.05)；與模型組比較，PUE組、Re-H組可明顯降低CK、LDH的含量(P<0.05)；Re-H組和Re-L組MDA含量明顯降低(P<0.05)，PUE組和Re-H組GSH-Px含量明顯升高(P<0.05)；SOD含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其變化趨勢(shì)與GSH含量的變化一致。

2.3各組大鼠心肌Bax、Bcl-2表達(dá)變化如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，模型組Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低；Bax蛋白陽性胞質(zhì)多位于心肌缺血區(qū)周圍的心肌細(xì)胞，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，PUE、Re-H、Re-L三組Bax蛋白陽性胞質(zhì)數(shù)減少，蛋白表達(dá)降低，Re-H組表達(dá)降低更明顯；三組Bcl-2蛋白陽性胞質(zhì)數(shù)增強(qiáng)，蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Re-H組表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)。

Fig1EffectsonmicrocirculationbloodflowinmyocardiumofISO-inducedacutemyocardialischemiarats

A: The microcirculation of heart surface of each group; B：The statistics microcirculation of heart surface of each group.#P<0.05 νs control;*P<0.05vsmodel

Fig2ExpressionofBaxandBcl-2protein(A)andBcl-2/Baxratio(B)inmyocardiumofISO-inducedacutemyocardialischemiarats(×400)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

Tab 1 Effects on CK, LDH, MDA, SOD and GSH levels in myocardium of ISO-induced acute myocardial ischemia rats (±s, n=10)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

2.4各組大鼠心肌JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3的表達(dá)如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，PUE、Re-H組可以明顯增強(qiáng)心肌組織JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平(P<0.05)。

3 討論

ISO導(dǎo)致心肌缺血、缺氧的主要原因是兒茶酚胺類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物[7]。本研究采用這種無創(chuàng)的操作制備急性心肌缺血模型，通過給予人參皂苷Re，研究了其對(duì)心肌缺血損傷心肌JAK/STAT信號(hào)通路的作用。

氧化應(yīng)激常發(fā)生于心肌缺血中，急性缺血時(shí)，心肌產(chǎn)生大量氧自由基，容易引起細(xì)胞壞死或者凋亡[8]。SOD、GSH是抗氧化系統(tǒng)中的重要組成部分，組織中的相關(guān)抗氧化物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化可以體現(xiàn)機(jī)體的抗氧化能力[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠急性心肌缺血后LDH、CK含量有所提高，說明急性心肌缺血大鼠出現(xiàn)了心肌損傷，同時(shí)PUE、Re-H、Re-L組都能同時(shí)改善以上情況，說明人參皂苷Re對(duì)急性心肌缺血大鼠起到保護(hù)作用。MDA含量明顯增加，SOD、GSH活性降低，給予高劑量人參皂苷Re處理后，SOD活性有所增加，提示人參皂苷Re可抑制氧化應(yīng)激，同時(shí)人參皂苷Re可增加心肌的血流量，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌缺血大鼠心肌的保護(hù)作用。

Fig 3 Effect on expression of JAK2, p-JAK2(A), STAT3 and p-STAT3 (B) protein in myocardium of ISO-induced acute myocardial ischemia rats#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs model

JAK-STAT信號(hào)通路是涉及免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過程的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。哺乳動(dòng)物JAK/STAT信號(hào)通路共有4個(gè)JAK家族成員和7個(gè)STAT家族成員組成，4個(gè)JAK家族成員分別為JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2; STAT 家族成員分別為 SATA1、2、3、4、5a、5b、6。許多細(xì)胞外信號(hào)能夠激活JAK-STAT通路，這些細(xì)胞外信號(hào)與靶細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合后活化JAK，進(jìn)一步磷酸化STAT，2個(gè)磷酸化的STAT分子形成二聚體并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與靶基因DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[10]。Bcl-2家族按其功能可分為抗凋亡的Bcl-2亞族和促凋亡的Bax亞族，心肌損傷會(huì)導(dǎo)致Bax蛋白表達(dá)增多。在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，Bcl-2/Bax在細(xì)胞凋亡過程中具有重要意義。有研究顯示，STAT1、STAT3的過度活化有促進(jìn)神經(jīng)元凋亡的作用，能降低抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x的表達(dá)[11]。有研究證明[12-13]， JAK2-STAT3通路在缺血預(yù)處理，特別是預(yù)處理的晚期心肌保護(hù)機(jī)制中具有核心地位，它通過上調(diào)抗凋亡蛋白比例以及NOS、COX-2等保護(hù)蛋白，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

本研究顯示，人參皂苷Re可以明顯改善ISO誘導(dǎo)的心肌缺血小鼠心肌血流量變化，減少血清中心肌損傷酶的含量，增加Bcl-2/Bax比值，并上調(diào)JAK2/STAT3的磷酸化水平。提示人參皂苷Re作為人參的重要活性成分，具有明顯的抗心肌缺血作用，其機(jī)制可能與增加心肌血流量，穩(wěn)定機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)及JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

[1] Peng L，Sun S，Xie L H，et al. Ginsenoside Re: pharmacologicaleffects on cardiovascular system[J].CardiovascTherap，2012，30(4):183-8．

[2] Xie J T，Shao Z H，Vanden Hoek T L，et al. Antioxidant effects of ginsenoside Re in cardiomyocytes[J]．EurJPharmacol，2006，532(3): 201-7．

[3] 高 瑩，楊積武，王艷春，等. 人參皂苷Re對(duì)大鼠心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡及Caspase-3的影響[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011,13(2):123-4.

[3] GaoY,Yang J W, Wang Y C, et al. Effects of ginsenoside Re on apoptosis and caspase-3 expression in myocardial ischemia reperfusion rats [J].JLiaoningUnivTraditChinMed, 2011,13(2): 123-4.

[4] 冷 雪，臧安緣，李其芳.人參皂苷Rg1通過 PI3K /Akt /eNOS信號(hào)通路調(diào)控異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2017,23(11):145-50.

[4] Leng X, Zang A Y, Li Q F, et al. Ginsenoside Rg1 through PI3K/Akt/eNOS signal pathway regulation of isoproterenol induced acute myocardial ischemia rat myocardial antioxidant [J].ChinJExpTraditChinMed, 2017,23(11): 145-50.

[5] 冷 雪，張立德，賈連群，等.人參皂苷Rb1對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血影響的作用機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(24):104-8.

[5] Leng X, Zang A Y, Li Q F, et al. Effects of ginsenoside Rb1 on isoprenaline-induced acute myocardial ischemia in rats [J].JExpTraditChinMed, 2015,21(24): 104-8.

[6] Zhang M, Wang X, Wang X, et al. Oxymatrine protects against myocardial injury via inhibition of JAK2/STAT3 signal in rat septic shock[J].MolMedRep, 2013,7(4):1293-9.

[7] 牛子冉，徐曉娜，陳俞材，等.丹酚酸A 對(duì)異丙腎上腺素致小鼠心肌缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31(12):1667-74.

[7] Niu Z R, Xu X N, Chen Y C, et al. Effect of salvianolic acid A on isoproterenol-induced myocardial ischemia in mice and its mechanism [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(12): 1667-74.

[8] Giordano F J. Oxygen,oxidative stress,hypoxia,and hearu failure[J].JClinInvest, 2005,115(3)：500-8.

[9] Khatua T N，Padiya R，Karnewar S，et al． Garlic provides protection to mice heart against isoproterenol induced oxidative damage:role of nitric oxide[J]．NitricOxide，2012，27(1) : 9-17．

[10] 黃文林，朱孝峰．信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:182-91.

[10] Hang W L,Zhu X F.Signaltransduction[M]. Beijing: People's Health Publishing House, 2005: 182-91.

[11] 楊志宏，胡 亞，孫曉波. JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及中藥干預(yù)在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2016，32(7):889-94.

[11] Yang Z H, Hu Y, Sun X B. JAK/STAT signal transduction pathway and traditional Chinese intervention in ischemic stroke [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(7): 889-94.

[12] Gross E R，Hsu A K，Gross G J． The JAK-STAT pathwayis essential for opioid-induced cardioproteetion: JAK2 as amediator of STAT3，Akt， and GSK-3 beta[J]．AmJPhysiolHeartCitePhysiol，2006，291(2):H827-34．

[13] 顏麗暉，江曉菁. JAK2-STAT3 通路對(duì)七氟烷后處理在體大鼠缺血/再灌注心肌的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2011,27(10):1368-73.

[13] Yan L H, Jiang X Q. JAK2-STAT3 pathway on ischemic/reperfusion myocardium in rats after pretreatment of sevoflurane [J].ChinPharmacolBull, 2011,27(10): 1368 -73.