臧慧梅，蘇 磊，陳家政，閆 濤，林家茂，房麗君

(1. 山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012； 2.山東省腫瘤防治研究院，山東 濟(jì)南 250117；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250011)

糖尿病(diabetes melitus，DM)是由遺傳和環(huán)境因素使胰島素分泌不足或胰島素抵抗而引起的，以血糖升高為特征，嚴(yán)重危害人類健康的慢性代謝綜合征[1]。其中，2型糖尿病(T2DM)的特點(diǎn)是高糖血癥和高胰島素血癥，其發(fā)病率約占糖尿病總數(shù)的90%以上。全球共有4.15億成年人患有糖尿病，即每11個(gè)成人中便有1人患有糖尿病[2]。糖尿病患者約2/3死于心臟病和腦中風(fēng)，其風(fēng)險(xiǎn)比正常人群高2～4倍[1]。其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的主要心臟并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的重要原因。糖尿病心肌病的病理改變主要表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化。

丹酚酸B(salvianolic acid B ,Sal B)是從丹參中提取出的藥用水溶性成分，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，Sal B能夠抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[6]，降低db/db小鼠的血糖水平[7]，但Sal B能否改善糖尿病小鼠心肌肥厚，尚未見報(bào)道。過氧化物酶體增殖物激活受體α (peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)廣泛分布于心肌細(xì)胞，是生理情況下心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝和能量代謝重要的調(diào)控樞紐，參與了糖尿病心肌肥厚的演變過程[8-9]。本研究擬從動(dòng)物及細(xì)胞水平研究Sal B對T2DM模型小鼠心肌肥厚的影響，并從PPARα角度探討其機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，1～3 d齡，清潔級；C57BL/6J小鼠，5周齡，清潔級。以上動(dòng)物均由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(魯) 2013 0009。

1.2試劑丹酚酸B購于上海Tauto Biotech公司，HPLC分析示純度超過98%。DMEM培養(yǎng)基、HBSS(無鈣鎂)購于美國Gibco公司；II型膠原酶購自美國Worthington公司；普通飼料及高脂飼料購于北京華阜康公司；羅氏活力型血糖儀及試紙條購自美國羅氏公司；鏈脲佐菌素(STZ)、DMSO購于美國Sigma-Aldrich公司；MK-886購自美國Abcam公司；3H-亮氨酸、3H-D-葡萄糖購自美國Perkin Elmer公司；PPARα抗體(貨號ab8934)購自美國Abcam公司；GAPDH抗體(貨號G9545)購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA試劑盒、LDH試劑盒購于碧云天公司。

1.3儀器石蠟切片機(jī)，購自德國Leica公司；Image Proplus 6.0 software購自美國MediaCybernetics公司；生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；液體閃爍計(jì)數(shù)儀購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；正置熒光顯微鏡(Eclipse Ti)購自日本尼康公司；離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；發(fā)光儀及電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的建立及分組采用高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合STZ腹腔注射的方法誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生T2DM表現(xiàn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取110只5周齡的C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為2組：正常飼養(yǎng)組40只、T2DM造模組70只。正常飼養(yǎng)組采用普通飼料(質(zhì)量比g%：4.3% 脂肪，67.3% 碳水化合物以及19.2%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)4周；T2DM造模組采用高脂飼料(質(zhì)量比g%：24% 脂肪，41% 碳水化合物以及24%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)4周。4周后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射40 mg·kg-1STZ(溶于0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液中，pH 4.4，冰浴，現(xiàn)配現(xiàn)用，5 min內(nèi)用完)，繼續(xù)高脂飼養(yǎng)；正常組注射等體積的檸檬酸緩沖液，繼續(xù)正常飲食飼養(yǎng)。注射 STZ 后d 3、7尾靜脈采血檢測血糖，血糖值連續(xù)2次大于11.1 mmol·L-1視為T2DM造模成功。如血糖不合格則再次注射 STZ。將存活的正常飼養(yǎng)組小鼠隨機(jī)分為2組：對照組(18只)、丹酚酸B組(17只)；將存活的、成模的T2DM小鼠隨機(jī)分為2組：T2DM模型組(20只)、T2DM+丹酚酸B組(17只)。之后T2DM+Sal B組和Sal B組采用Sal B 100 mg·kg-1·d-1灌胃8周，對照組及T2DM組使用生理鹽水灌胃8周。

2.2取材稱取小鼠體重，0.8%戊巴比妥鈉(70 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開胸腔，將針頭插入左心室，生理鹽水灌注至肝臟顏色發(fā)白，取下心臟稱重。取出小鼠脛骨，用游標(biāo)卡尺測其長度，計(jì)算心臟重量(mg)與脛骨長度(mm)的比例。

2.3石蠟切片麥胚凝集素(WGA)染色心肌組織甲醛固定后脫水，石蠟包埋，0.5 μm切片，脫蠟至水，微波抗原修復(fù)15 min，PBS沖洗15 min(每次5 min)，滴加5 mg·L-1WGA染液，置于暗盒內(nèi)并4℃過夜，d 2沖洗后，抗熒光淬滅封片劑封片，正置熒光顯微鏡拍片。每組隨機(jī)選取6只小鼠的心臟，每個(gè)心臟選取相同位置的3張切片，每個(gè)切片選取6個(gè)視野拍照，照片使用Image Proplus 6.0圖形分析系統(tǒng)，計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面面積。

2.4乳大鼠心肌細(xì)胞的提取及分組該細(xì)胞的提取及培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中，使用25.5 mmol·L-1葡萄糖聯(lián)合0.1 μmol·L-1胰島素(high glucose and insulin, HGI)誘導(dǎo)乳大鼠心肌細(xì)胞的肥大生長。各個(gè)實(shí)驗(yàn)的具體分組及刺激方法詳見圖表的圖注。

2.5心肌細(xì)胞表面積的測量乳大鼠心肌細(xì)胞表面積通過α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)免疫熒光染色測定，基本步驟參考文獻(xiàn)[10]。每組細(xì)胞隨機(jī)選擇8個(gè)視野拍照，使用Image Proplus 6.0 software測量細(xì)胞表面積。

2.63H-亮氨酸參入率測定采用24孔板培養(yǎng)，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板，心肌細(xì)胞貼壁后換液，再培養(yǎng)24 h后無血清饑餓過夜，換用含有相應(yīng)刺激的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，3H-亮氨酸在細(xì)胞培養(yǎng)液中終濃度為1 mCi·L-1。樣品制備及檢測參考文獻(xiàn)[10]。結(jié)果以每分鐘計(jì)數(shù)(counts per minute, cpm)表示，參入量反映心肌細(xì)胞的蛋白合成速率。

2.73H-D-葡萄糖參入率采用3H-D-葡萄糖參入實(shí)驗(yàn)評價(jià)心肌細(xì)胞胰島素敏感性。培養(yǎng)采用24孔板，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板，心肌細(xì)胞貼壁后換液，再培養(yǎng) 24 h后無血清饑餓過夜，換用含有相應(yīng)刺激的培養(yǎng)基，經(jīng)37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，加入3H-D-葡萄糖(1.3 mCi·L-1)繼續(xù)孵育1 h。PBS冰上快速?zèng)_洗細(xì)胞3次，0.5 mol·L-1NaOH于37℃裂解細(xì)胞30 min，然后加入等體積0.5 mol·L-1HCl中和。使用BCA測定蛋白濃度。閃爍瓶中加入5 mL閃爍液及細(xì)胞裂解物，搖勻，使用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測。結(jié)果以每分鐘計(jì)數(shù)/mg蛋白(CPM·mg-1)，反映心肌細(xì)胞的3H-D-葡萄糖參入率。然后轉(zhuǎn)換成比值。

2.8乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測培養(yǎng)采用24孔板，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板，心肌細(xì)胞貼壁后換液，再培養(yǎng)24 h后饑餓過夜，換用含藥培養(yǎng)基孵育48 h，將上清吸出。96孔板中每孔加入100 μL上清，然后再加入100 μL LDH試劑，避光室溫放置30 min。酶標(biāo)儀下，490 nm波長處讀取吸光度值。

2.9Westernblot檢測蛋白的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)所用乳大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)采用6孔板，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板，心肌細(xì)胞貼壁后換液，再培養(yǎng)24 h后無血清饑餓過夜，換用含有相應(yīng)刺激的培養(yǎng)基，經(jīng)37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。提取乳大鼠心肌細(xì)胞或小鼠心臟組織蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入含有β-巰基乙醇的上樣緩沖液，金屬浴95℃10 min,使蛋白變性，-80℃保存。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入一抗稀釋液配置的一抗(GAPDH 1 ∶2 000稀釋，PPARα 1 ∶1 000稀釋)。搖床4℃封閉過夜，d 2洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶30 000稀釋)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液(1 ∶1等比例避光配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)顯色，Image J圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析。每組重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1丹酚酸B對T2DM模型小鼠心肌肥厚的影響心臟重量/脛骨長度比例、心肌細(xì)胞橫截面積能夠反映小鼠的心肌肥厚程度。如Fig 1所示，與對照組相比，T2DM組小鼠心臟重量與脛骨長度(HW/Tibial length)比值、心肌細(xì)胞橫截面積明顯升高(P<0.01)；T2DM+Sal B組該比值明顯低于T2DM組(P<0.05)；Sal B組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示糖尿病狀態(tài)使小鼠產(chǎn)生心肌肥厚，丹酚酸B能夠改善T2DM小鼠的心肌肥厚。

3.2丹酚酸B對T2DM小鼠心肌組織PPARα表達(dá)水平的影響如Fig 2所示，T2DM組PPARα表達(dá)水平較對照組明顯下降(P<0.01)，T2DM+Sal B組PPARα表達(dá)較T2DM組上升(P<0.01)。提示丹酚酸B能夠改善T2DM引起的小鼠心肌組織PPARα的表達(dá)降低。

3.3丹酚酸B對乳大鼠心肌細(xì)胞活力的影響如Fig 3所示，相對于對照組，1～10 μmol·L-1的Sal B沒有增加乳大鼠心肌細(xì)胞的死亡，100 μmol·L-1的Sal B還能降低無血清培養(yǎng)造成的乳大鼠心肌細(xì)胞的死亡(P<0.05)。

3.4丹酚酸B對高糖高胰島素誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響3H-亮氨酸參入率能夠反映心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成速率，和心肌細(xì)胞表面積都是檢測心肌細(xì)胞肥大的常用指標(biāo)。Fig 4顯示，HGI作用48 h后，心肌細(xì)胞3H-亮氨酸參入率明顯高于control組(P<0.01)。Sal B干預(yù)后，3H-亮氨酸參入率出現(xiàn)不同程度下降，以Sal B 100 μmol·L-1降低最為明顯(與HGI組相比P<0.01)。

3.5丹酚酸B通過PPARα改善高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗如Fig 5A所示，HGI組PPARα的表達(dá)與對照組相比明顯下降(P<0.01)，Sal B(100 μmol·L-1)能夠改善HGI引起的PPARα表達(dá)水平下降(P<0.01)。PPARα抑制劑MK886(50 μmol·L-1)干預(yù)后，HGI+Sal B+MK886組PPARα表達(dá)較HGI+Sal B組明顯下降(P<0.01)。胰島素抵抗能引起細(xì)胞的3H-D-葡萄糖參入率下降。如Fig 5B所示，干預(yù)48 h后，HGI組心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖參入率與control組相比明顯下降(P<0.01)；加入100 μmol·L-1Sal B后，HGI+Sal B組3H-D-葡萄糖參入率較HGI組明顯上升(P<0.01)；而PPARα抑制劑MK886能夠使SalB的上述效應(yīng)降低(P<0.01)?？梢?，Sal B 能夠改善高糖、高胰島素誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，其作用是通過激動(dòng)PPARα發(fā)揮的。

Fig 1 Effect of Sal B on heart weight/tibial length(A) and myocardial cross-sectional area(B) in mice with type 2 diabetes melitus

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group

Fig 2 Effect of Sal B on protein level of PPARα in hearts of mice with type 2 diabetes melitus

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsT2DM group

Fig 3 Effect of Sal B on viability of NRCMs

Neonatal rat cardiomyocytes(NRCMs) were treated with Sal B(1～100 μmol·L-1) for 48 h, then LDH level of the supernatant was measured.*P<0.05 vs control group.

3.6丹酚酸B通過PPARα改善胰島素抵抗引起的心肌細(xì)胞肥大如Fig 6所示，與control組相比，HGI組心肌細(xì)胞表面積及亮氨酸參入率明顯增加(P<0.01)；Sal B(100 μmol·L-1)刺激后，HGI+Sal B組心肌細(xì)胞面積及亮氨酸參入率較HGI組相比明顯減少(P<0.01)；而HGI+Sal B+MK886組心肌細(xì)胞面積及亮氨酸參入率明顯高于HGI+Sal B組(P<0.01)。說明Sal B可以抑制HGI引起的心肌細(xì)胞肥大，而這種作用可被PPARα抑制劑MK886所逆轉(zhuǎn)。

Fig 4 Effect of Sal B on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and high insulin

NRCMs were treated with glucose(25.5 mmol·L-1), insulin(0.1 μmol·L-1)and Sal B(1～100 μmol·L-1) for 48 h, then3H-leucine incorporation of cells was measured.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGI group.

Fig 5 Effect of Sal B and MK886 on PPARα expression(A) and 3H-D-glucose incorporation (B) induced by HGI in cardiomyocytes

NRCMs were treated with glucose(25.5 mmol·L-1),insulin(0.1 μmol·L-1),Sal B(100 μmol·L-1) and MK886(50 μmol·L-1) for 48 h, then PPARα level and3H-D-glucose incorporation of cells were measured.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGI group;△△P<0.01vsHGI+Sal B group.

Fig 6 Effect of Sal B and MK886 on cardiomyocyte hypertrophy induced by insulin resistance

A: Cell surface area; B:3H-leucine incorporation. NRCMs were treated with glucose(25.5 mmol·L-1),insulin(0.1 μmol·L-1), Sal B(100 μmol·L-1) and MK886(50 μmol·L-1) for 48 h, then cell surface area and3H-leucine incorporation were measured.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGI group;△△P<0.01vsHGI+Sal B group.

4 討論

DCM是T2DM患者常見的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，以心室肥厚、順應(yīng)性降低、峰充盈率減少為主要特點(diǎn)。其中，心肌肥厚是DCM關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)改變之一，也是造成病人死亡的病理基礎(chǔ)。研究證明，高糖和高胰島素均可獨(dú)立參與T2DM患者糖尿病心肌肥厚的形成。此外，T2DM患者多伴有胰島素抵抗(insulin resistance, IR)，IR是引起糖脂代謝紊亂的重要因素，也是T2DM的核心病機(jī)[11-12]。

在高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中， Sal B能夠抑制PPARγ的表達(dá)水平，減輕胰島素抵抗，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕小鼠體重[13]。但對糖尿病引起的心肌肥大尚無明確報(bào)道。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，Sal B能夠明顯縮小T2DM小鼠心肌細(xì)胞橫截面面積，降低心臟重量/脛骨長度比值，改善T2DM小鼠的心肌肥厚。在HGI誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大中，Sal B的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)了HGI誘導(dǎo)下3H-D-葡萄糖參入率和3H-亮氨酸參入率的變化，提示Sal B能夠改善HGI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗和肥大生長。

PPARα是過氧化物酶受體增殖物激活受體(PPARs)成員，也是二型核受體超家族的成員，屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,與糖尿病心肌肥厚的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。本研究中，小鼠心肌組織Western blot結(jié)果證實(shí)了糖尿病狀態(tài)下PPARα表達(dá)下降，而Sal B的應(yīng)用使PPARα表達(dá)上調(diào)，乳大鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)論。我們使用PPARα抑制劑MK886后發(fā)現(xiàn)，Sal B改善心肌細(xì)胞肥大的作用可被MK886所消除，3H-亮氨酸參入率上升，這表明Sal B對心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用與PPARα具有相關(guān)性。

綜上所述，Sal B能有效改善T2DM模型小鼠的心肌肥厚，其機(jī)制可能是通過激活PPARα發(fā)揮的。

(致謝：實(shí)驗(yàn)在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院細(xì)胞治療研究中心完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師們的無私幫助！)

[1] Deshpande A D, Harris-Hayes M, Schootman M. Epidemiology of diabetes and diabetes-related complications[J].PhysTher, 2008,88(11):1254-64.

[2] International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas. 7th Edition, 2015. Available at http://www.idf.org/.

[3] Lin C, Liu Z, Lu Y, et al. Cardioprotective effect of Salvianolic acid B on acute myocardial infarction by promoting autophagy and neovascularization and inhibiting apoptosis[J].JPharmPharmacol, 2016,68(7): 941-52.

[4] 陳俞材, 方蓮花, 杜冠華. 丹參水溶性化合物抗心肌缺血作用的研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(2):162-5.

[4] Chen Y C, Fang L H, Du G H. Research advances in protective effects of water soluble compounds in alvia miltiorrhiza gainst myocardial ischemia[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(2):162-5.

[5] 崔國禎,徐燕玲,孫安露,等.丹參素衍生物對斑馬魚促血管新生作用的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2016,32(6):795-800.

[5] Cui G Z, Xu Y L,Sun A L,et al. Effect of Danshensu derivative on angiogenesis in zebrafish[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(6):795-800.

[6] Liu M, Ye J, Gao S, et al. Salvianolic acid B protects cardiomyocytes from angiotensin II-induced hypertrophy via inhibition of PARP-1[J].BiochemBiophysResCommun, 2014,444(3):346-53.

[7] Huang M Q, Zhou C J, Zhang Y P, et al. Salvianolic acid B ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia in db/db mice through the AMPK pathway[J].CeLPhysiolBiochem, 2016,40(5):933-43.

[8] Dobrin J S, Lebeche D. Diabetic cardiomyopathy: signaling defects and therapeutic approaches[J].ExpertRevCardiovascTher, 2010,8(3):373-91.

[9] Liu F, Song R, Feng Y, et al. Upregulation of MG53 induces diabetic cardiomyopathy through transcriptional activation of peroxisome proliferation-activated receptor α[J].Circulation, 2015,131(9):795-804.

[10] Lyu L, Wang H, Li B, et al. A critical role of cardiac fibroblast-derived exosomes in activating renin angiotensin system in cardiomyocytes[J].JMolCellCardiol, 2015,89(Pt B): 268-79.

[11] Peng X, Chen R, Wu Y, et al. PPARgamma-PI3K/AKT-NO signal pathway is involved in cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and insulin[J].JDiabetesComplications, 2015,29(6):755-60.

[12] 吳文君,湯孫寅炎,時(shí)俊鋒,等.二甲雙胍抑制SREBP-1c改善高脂誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素抵抗[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2016,32(1):55-9.

[12] Wu W J,Tang-Sun Y Y,Shi J F,et al. Metformin ameliorates PA-induced skeletal muscle insulin resistance by suppressing SREBP-1c[J].ChinPharmacolBull,2016,32(1):55-9.

[13] Wang P, Xu S, Li W, et al. Salvianolic acid B inhibited PPARγ expression and attenuated weight gain in mice with high-fat diet-induced obesity[J].CeLPhysiolBiochem, 2014,34(2):288-98.