石明芯，胡江波，晏聲蕾，趙 靜，張景勍

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2. 重慶市南岸區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心藥劑科，重慶 400060)

吳茱萸是蕓香科植物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[1]。吳茱萸堿(evodiamine，ED)是吳茱萸的一種重要生物堿，近年來研究表明，它除了與吳茱萸有相同的作用外，在抑制腫瘤細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等方面也具有突出作用[2-6]，作用范圍廣泛，且具有一定研究開發(fā)價(jià)值。但由于ED水溶性弱，導(dǎo)致口服吸收差，為此改善其口服吸收，以便更好地發(fā)揮其抗腫瘤等作用尤其重要。近年來，微乳液遞送系統(tǒng)以其能提高藥物的溶解度、改善藥物吸收和生物利用度等作用而成為研究熱點(diǎn)[7]。ED的微乳液遞送技術(shù)研究甚少，故本實(shí)驗(yàn)將ED制備成吳茱萸堿微乳液(evodiamine microemulsion，EDM)，考察其在體外的釋放特征，并研究其在大鼠的胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸等部位的吸收情況，該實(shí)驗(yàn)用HPLC法測定其含量。

1 材料

1.1動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(230±20) g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0001。

1.2試劑與儀器ED (武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，純度>99%)；油酸乙酯(上?；瘜W(xué)試劑二廠，分析純)；聚氧乙烯蓖麻油(德國BASF公司)；聚乙二醇400(天津精細(xì)化工有限公司，分析純)；Krebs-Ringer液(實(shí)驗(yàn)室自制，批號：20121113)；甲醇(美國新天地科技有限公司，色譜純)；水為純化水；其余試劑為分析純。1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1EDM的制備稱取處方量的ED、油酸乙酯、聚氧乙烯蓖麻油以及聚乙二醇400，磁力攪拌后冷卻到室溫，滴加處方量的純化水，攪拌至澄清，即得EDM，測得其平均粒徑為26 nm，平均Zeta電位為-15 mV。

2.2樣品的分析

2.2.1色譜條件 色譜柱為Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35℃，檢測波長225 nm，流動(dòng)相為甲醇 ∶水=75 ∶25，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2樣品處理 將樣品液和甲醇以一定體積比混合，渦旋2 min，再于12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得樣品。

2.3EDM的體外釋放動(dòng)力學(xué)將處理好的透析袋的一端結(jié)扎，精密量取1.0 mL ED或EDM置透析袋中，緊緊將另一端結(jié)扎。將此透析袋浸沒到50 mL pH 1.2鹽酸溶液和pH 6.8磷酸緩沖液的透析液中，于37℃、100 r·min-1水浴條件下恒溫振蕩，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣?？疾霦D或EDM在pH 1.2鹽酸溶液或pH 6.8磷酸緩沖液中的釋放行為，于“2.2”項(xiàng)下色譜條件測得含量，對ED和EDM的釋放情況作相對因子計(jì)算[8]，計(jì)算其累積釋放率，并對其累積釋放率和時(shí)間進(jìn)行零級方程、一級方程、Higuchi方程、Hixcon-Crowell方程、Ritger-peppas方程、Weibull方程擬合分析。

2.4EDM的大鼠胃腸吸收研究

2.4.1主要溶液配制 Krebs-Ringer液參照文獻(xiàn)[10]配制方法配制；ED循環(huán)液：精密稱取10 mg ED，用Krebs-Ringer液稀釋并定容至100 mL，即配制成的ED循環(huán)液(100 mg·L-1)。同理配制EDM循環(huán)液(100 mg·L-1)。

2.4.2大鼠胃腸吸收實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將6只大鼠隨機(jī)分成2組，并給予大鼠禁食18 h，不禁水的處理，分別研究ED或EDM在大鼠胃腸的吸收情況。實(shí)驗(yàn)時(shí)用3.5%的水合氯醛麻醉大鼠，沿腹中線打開腹腔，找到胃并排除內(nèi)容物后，灌入4 mL ED或EDM，2 h后取出藥液并定容至刻度；然后分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等4段形成回路，除凈腸內(nèi)容物后用Krebs-Ringer液循環(huán)，再通入ED或EDM，1 h后取出藥液并定容至刻度，得樣品，-20℃保存[9-10]。用HPLC測得ED的含量后，計(jì)算ED或EDM的吸收速率常數(shù)(absorption rate constant，Ka)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)后剪下的各腸段的內(nèi)徑和長度，計(jì)算二者的有效滲透率(effective permeability，Peff)[11]。

3 結(jié)果

3.1EDM的體外釋放動(dòng)力學(xué)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得出ED與EDM在pH 1.2鹽酸溶液中的相對因子為20.80，在pH 6.8磷酸緩沖液中的18.59，說明二者的釋放行為不相似。ED和EDM在pH 1.2鹽酸溶液中的釋放情況如Fig 1所示，累積釋放率分別為(13.98±0.49)%、(64.76±0.73)%，EDM的累積釋放率為ED的4.63倍；在pH 6.8磷酸緩沖液中的釋放情況如Fig 2所示，累積釋放率分別為(18.34±0.20)%、(91.72±0.51)%，EDM的累積釋放率為ED的5.01倍。在pH 1.2鹽酸溶液和pH 6.8磷酸緩沖液中，EDM在0～12 h時(shí)，累積釋放速率一直處于增長狀態(tài)，于12 h后，累積釋放速率開始變緩；而ED在0～5 h時(shí)均處于增長狀態(tài)，其后一直處于平穩(wěn)狀態(tài)。表明將ED制備成EDM后，達(dá)到最大累積釋放速率的時(shí)間相對延長，并且體外釋放量明顯增加。

EDM的累積釋放率和時(shí)間的各方程擬合情況見Tab 1、2，EDM在pH 1.2鹽酸溶液和pH 6.8磷酸緩沖液中的釋放與各方程的擬合度均大于0.700，說明擬合效果較好；在兩溶液中的釋放與Weibull方程擬合度最高，說明EDM在兩溶液中的釋放與Weibull方程最符合。

Fig 1 Drug release curves of ED and EDM in pH 1.2 HCl

Fig 2 Drug release curves of ED and EDM in pH 6.8 PBS

FittingmodelspH1.2HCldissolutionmediaEquationsDegreesoffittingZero-orderequationQ=0.257t+31.4000.729First-orderequationln(1-Q)=-0.004t-0.4090.806HiguchiequationlnQ=4.022t1/2+21.1500.840Hixcon-Crowellequation(100-Q)1/3=-0.005t+4.0630.781Ritger-peppasequationlnQ=0.453lnt+2.2370.848Weibullequationlnln[1/1-Q]=0.533lnt+2.2890.878

Tab 2 Mathematical models of mean cumulative release rate versus time of EDM in pH 6.8 PBS dissolution media

3.2EDM的大鼠胃腸吸收研究通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到ED和EDM在各部位的Ka(Fig 3)和Peff(Fig 4)，可得出結(jié)果：EDM在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、胃的Ka分別是ED的2.86、2.66、3.06、4.55、2.62倍，在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Peff分別是ED的4.27、2.21、2.38、4.30倍，即EDM在各部位的Ka和Peff均為ED的2倍以上，說明EDM在各部位的吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ED，EDM能明顯提高ED在大鼠胃腸中的吸收；且各腸段的Ka均為胃的3倍以上，說明ED在腸段中的吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其在胃中吸收。

Fig 3 Absorption rate constant of ED and EDM (±s,n=3)

Fig 4 Effective permeability of ED and EDM (±s,n=3)

4 討論

ED作為一種可抗腫瘤的藥物被廣為使用，但由于存在水溶性差、口服吸收弱等問題，導(dǎo)致生物利用度低，因此提高其口服吸收很有必要。近期研究發(fā)現(xiàn)，新興的微乳液遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性好，能有效提高藥物的吸收和生物利用度[12-14]，在食品、醫(yī)藥和化妝品上都有所應(yīng)用。但關(guān)于ED的微乳液遞送系統(tǒng)研究不多，故本實(shí)驗(yàn)將ED制備成EDM，研究其體外釋放特征和在胃腸吸收情況。

在體外釋放研究中，ED與EDM的相對因子均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于50，說明了ED與EDM體外釋放特征不相似；EDM的體外累積釋放率高于ED，在pH 1.2鹽酸溶液中增加了3.63倍，在pH 6.8磷酸緩沖液中增加了4.01倍；且EDM達(dá)到最大釋放量的時(shí)間與ED相比，延長了5 h。說明EDM不僅大大提高了ED的體外釋放量，還實(shí)現(xiàn)了緩釋，延長了作用時(shí)間。

在體吸收實(shí)驗(yàn)中，EDM與ED相比，胃腸道吸收量明顯增長了1倍以上，可能是微乳液遞送系統(tǒng)提高了ED與胃腸道的親和力，提高了ED在胃腸道中的溶解度，促進(jìn)了胃腸道吸收[7,14]。綜上表明微乳液遞送系統(tǒng)不僅延緩了ED吸收，延長其作用時(shí)間，也提高了其胃腸吸收，對于改善其口服生物利用度低等問題提供了參考依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物高校工程研究中心完成，真誠感謝實(shí)驗(yàn)室的所有老師和同學(xué)。)

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