王麗麗, 馬如風(fēng), 劉海霞, 朱如愿, 柳辰玥, 李 琳, 陳貝貝, 賈強(qiáng)強(qiáng)，高思華, 張東偉

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中藥學(xué)院、2. 中醫(yī)學(xué)院、3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險性增加為特征的全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病，其最大的風(fēng)險是骨折，尤其是髖部骨折，其中，近1/3的患者因此殘疾和死亡[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，飲食中脂肪和肉類豐富的西方女性骨質(zhì)疏松和骨折的發(fā)病率明顯高于飲食中豆類食品豐富的東方女性[2]。研究也表明，高脂飲食與骨質(zhì)疏松的發(fā)病密切相關(guān)。高脂飲食可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)紊亂，骨骼微環(huán)境改變和炎癥增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，最終導(dǎo)致骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density, BMD)下降，骨強(qiáng)度下降和骨微觀結(jié)構(gòu)惡化[3]。研究發(fā)現(xiàn)，♀ SD大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)3個月后體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量超過成骨細(xì)胞數(shù)量[4]。這說明高脂飲食促進(jìn)大鼠破骨細(xì)胞形成，抑制成骨細(xì)胞形成，使大鼠股骨的骨量丟失。同時，高脂飲食使機(jī)體抗氧化因子含量降低，炎癥遞質(zhì)釋放增加，促使小鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生[5]。同時，高脂飲食引起C57BL/6J小鼠下頜骨的骨量丟失[6]。

丹參是一種用于預(yù)防和治療心血管疾病的傳統(tǒng)中藥。近年來，越來越多的研究表明，以丹酚酸B為代表的水溶性成分具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，其作用機(jī)制可能與Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)以及叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O, FoxO)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等多種信號通路相關(guān)[7-8]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起小鼠牙槽骨的骨量丟失。而丹酚酸B可以通過改善高脂飲食引起的氧化應(yīng)激，從而抑制牙槽骨骨量丟失。其可能的機(jī)制是丹酚酸B通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4, Nox4)/核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)/組織蛋白酶K(cathepsin K)通路，改善牙槽骨骨量丟失[9]。但是，丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)的影響目前尚不清楚。因此，為了探索丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨代謝作用和可能的作用機(jī)制，本研究擬觀察丹酚酸B干預(yù)治療高脂飲食的C57BL/6J小鼠12周后，小鼠股骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)變化，以及其可能對氧化還原通路Nox4-NF-κB-cathepsin K的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 博勒飛質(zhì)構(gòu)儀CT3，美國BROOKFIELD公司；RM2255徠卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國Leica公司；BX53 倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.1.2試劑 骨組織抗原修復(fù)液，購自上海舜百生物科技有限公司；番紅O-固綠購自美國Sigma-Aldrich公司；cathepsin K抗體(ab19027)和NF-κB-p65抗體(ab16502)，購自美國Abcam Biocompany公司；Nox4多克隆抗體(NB110-58849)，購自美國Novus Biologicals公司；DAB顯色液，購自中杉金橋生物科技公司；高脂飼料(MD12032)，包括45%脂肪、20%蛋白質(zhì)和35%碳水化合物，購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6J ♂小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康動物科技有限公司。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級動物實(shí)驗(yàn)室，合格證號：SCXK京(2011-0024)，室溫(20±2)℃，相對濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠給予自由飲水。

1.2方法

1.2.1動物模型的構(gòu)建 同王麗麗等[9]提供的方法，簡述如下：將30只C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)等分為正常組、高脂組(HFD)和高脂+丹酚酸B(HFD+Sal B)組。高脂+丹酚酸B組每天給予丹酚酸B 125 mg·kg-1·d-1，正常組和高脂組小鼠每天給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃12周。實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠給予正常飼料飼養(yǎng)，其余兩組小鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)。

1.2.2取材及樣品制備 連續(xù)灌胃12周后，將小鼠用1%戊巴比妥(4 mL·kg-1)腹腔麻醉后，分離股骨。在冰上剝離股骨附著的肌肉組織，將其先置于10%中性福爾馬林中固定72 h，再放入15% EDTA鈉(pH 7.4)溶液脫鈣，脫鈣液每2周更換1次，連續(xù)脫鈣3個月后沖水，包埋，切片備用。

1.2.3股骨生物力學(xué)的測定 利用質(zhì)構(gòu)儀對各組小鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測定骨生物力學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)前，顯微鏡下觀察所有標(biāo)本，以確保所有測試標(biāo)本完好無損，并用游標(biāo)卡尺測量股骨股干的直徑。將小鼠股骨置于跨距為7 mm的兩個支撐點(diǎn)上，標(biāo)本的寬面朝上水平放置，按程序使探頭緩慢下降，探頭的加速度為10 mm·(min2)-1，標(biāo)本斷裂后繼續(xù)運(yùn)行2 mm停止。根據(jù)探頭下降的距離與載荷數(shù)據(jù)，結(jié)合千分尺測量出的骨標(biāo)本的斷端直徑生成骨的載荷-變形曲線，計(jì)算出最大撓度(maximum load，硬度形變量)和彈性載荷(elastic load，峰值壓力)等骨生物力學(xué)參數(shù)。

1.2.4股骨HE 染色 采用組織HE染色方法，簡述如下：將股骨石蠟切片(5 μm)常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.2.5番紅O-固綠染色 將股骨石蠟切片脫水，蘇木精染色5 min，在1% HCl-乙醇中蘸兩下分色，然后依次用0.05%固綠染色5 min，0.1%番紅O染色5 min。中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色 將股骨石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用抗原修復(fù)和山羊血清封閉后，分別滴加一抗NF-κB(1 ∶50)、Nox4(1 ∶50)和cathepsin K(1 ∶50)，4℃孵育過夜后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。每組選取股骨切片中7個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus 6. 0分析軟件進(jìn)行圖像分析，測定陽性細(xì)胞的平均吸光度，取7個視野平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨生物力學(xué)的影響各組小鼠股骨生物力學(xué)檢測結(jié)果見Tab 1，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨的硬度形變量和峰值壓力均明顯降低(P<0.05)。給予丹酚酸B治療12周后，與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨硬度形變量和峰值壓力均明顯升高(P<0.05)。

Tab 1 Effect of Sal B on changes of femur bone biomechanics in mice on high fat diet (±s, n=7)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsHFD

2.2丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨的微結(jié)構(gòu)的影響小鼠股骨組織切片HE染色結(jié)果見Fig 1。光鏡(×200)下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠股骨骨小梁排列整齊，呈網(wǎng)狀，骨微結(jié)構(gòu)完整。與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、變細(xì)、斷裂，脂滴增多。與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨的骨小梁排列相對整齊，骨微結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯改善，骨小梁增粗排列較規(guī)則。這說明丹酚酸B能夠通過改善高脂飲食引起的骨微結(jié)構(gòu)提高股骨質(zhì)量。

Fig 1 Effect of Sal B on microstructure alterations in femurs of mice on high fat diet (×200)A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B

2.3丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中糖氨基葡聚糖含量的影響糖氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是在軟骨中發(fā)現(xiàn)的天然的碳水化合物，與羥磷灰石結(jié)合后促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。如Fig 2番紅O-固綠染色結(jié)果所示，GAG被番紅O染成紅色。與正常組小鼠相比，高脂飲食小鼠股骨干骺端GAG的面積減少，丹酚酸B干預(yù)12周后，GAG的面積明顯增加，這提示丹酚酸B有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。

Fig 2 Effect of Sal B on content of glycosaminoglycan(GAG, red color) in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: GAG area in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

2.4丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中Nox4表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨小梁表面和骨髓腔中可見Nox4表達(dá)增高(P<0.05)。與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨中Nox4水平明顯降低(P<0.05)。說明丹酚酸B可抑制高脂飲食引起的小鼠股骨Nox4的高表達(dá)。

2.5丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中NF-κB-p65表達(dá)的影響如Fig 4所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨中骨小梁斷裂面以及骨髓腔中可見NF-κB-p65表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與高脂組小鼠相比，丹酚酸B治療12周后，小鼠股骨組織中NF-κB-p65的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

2.6丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中cathepsinK表達(dá)的影響cathepsin K主要由破骨細(xì)胞分泌，被認(rèn)為是破骨細(xì)胞活化和骨吸收的重要指標(biāo)[10]。如Fig 5免疫組化染色結(jié)果所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨中cathepsin K表達(dá)增高(P<0.05)。丹酚酸B干預(yù)12周后，高脂飲食小鼠股骨cathepsin K表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

3 結(jié)論

骨質(zhì)疏松的病理過程包括骨組織微結(jié)構(gòu)的破壞和骨骼脆性的增加。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可以促使小鼠牙槽骨骨質(zhì)疏松，而丹酚酸B可以明顯改善高脂飲食引起的牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨密度下降[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可以改善高飲食小鼠股骨的微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)中我們采用三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，通過對硬度形變量和峰值壓力指標(biāo)的檢測，證明丹酚酸B可以提高高脂飲食小鼠股骨的骨強(qiáng)度。

Fig 3 Effect of Sal B on Nox4 expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: Nox4 expression in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Fig 4 Effect of Sal B on NF-κB-p65 expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: NF-κB-p65 expression in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Fig 5 Effect of Sal B on cathepsin K expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Nox4主要由破骨細(xì)胞分泌，在破骨細(xì)胞分化和成熟的過程中表達(dá)增多。 Nox4的激活能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，從而誘發(fā)骨吸收，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。Nox4基因敲除小鼠骨密度升高，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，破骨細(xì)胞標(biāo)志物水平下降。骨質(zhì)疏松病人骨中的破骨細(xì)胞活性增加，Nox4表達(dá)增多[11]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起C57BL/6J小鼠Nox4的高表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB-p65高表達(dá)[12-13]。高脂飲食誘導(dǎo)小鼠牙槽骨中Nox4和NF-κB-p65的高表達(dá)[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B抑制高脂飲食小鼠股骨中Nox4和NF-κB表達(dá)。

骨骼由大約60%的鈣羥磷灰石和40%骨基質(zhì)蛋白構(gòu)成。其中，主要的蛋白是Ⅰ型膠原蛋白。cathepsin K是由破骨細(xì)胞分泌的發(fā)揮降解骨基質(zhì)蛋白最主要的酶，特別是對Ⅰ型膠原蛋白的降解[14]。NF-κB活化后可通過調(diào)節(jié)NFATc1等基因，促使cathepsin K的高表達(dá)，促使骨質(zhì)疏松的發(fā)生[9]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食能誘發(fā)小鼠牙槽骨組織的NF-κB的活化和cathepsin K的高表達(dá)，引起小鼠股骨微結(jié)構(gòu)破壞[9]。本研究也證明，高脂飲食可以使小鼠股骨組織的NF-κB和cathepsin K表達(dá)量上升，引起小鼠股骨強(qiáng)度下降和骨微結(jié)構(gòu)破壞。而給予丹酚酸B干預(yù)高脂飲食小鼠12周后，股骨中cathepsin K 表達(dá)下降，骨微結(jié)構(gòu)改善，骨強(qiáng)度有一定程度的提高。

軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)主要分為三類：①膠原類：以II型膠原為主，是維持組織強(qiáng)度的來源；②結(jié)構(gòu)糖蛋白：如纖維黏連蛋白；③蛋白多糖類：主要為GAG，包括硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和肝素。其中GAG是軟骨的主要細(xì)胞外基質(zhì)，是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分之一，占透明軟骨干重的20% ～40%[15]。GAG具有促進(jìn)成骨的作用。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素A具有促進(jìn)兔下頜骨的新骨形成。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可以提高高脂飲食小鼠股骨中GAG的含量。這表明丹酚酸B可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

綜上所述，高脂飲食小鼠表現(xiàn)出明顯的股骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降。丹酚酸B可通過調(diào)節(jié)Nox4/NF-κB/cathepsin K信號通路而改善股骨代謝。本研究也首次證明丹酚酸B具有抑制小鼠股骨cathepsin K表達(dá)的功能。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心進(jìn)行，對實(shí)驗(yàn)中給予指導(dǎo)和幫助的老師和同學(xué)表示感謝。)

[1] Baccaro L F, Conde D M, Costa-Paiva L, et al. The epidemiology and management of postmenopausal osteoporosis: a viewpoint from Brazil[J].ClinIntervAging， 2015,20(10):583-91.

[2] Ross P D, Norimatsu H, Davis J W, et al. A comparison of hip fracture incidence among native Japanese, Japanese Americans, and American caucasians [J].AmJEpidemiol, 1991,133(8):801-9.

[3] Tian L, Yu X. Fat, sugar, and bone health: a complex relationship [J].Nutrients, 2017, 9(5). pii: E506.

[4] 梁 潔, 宋文琦. 高脂飲食與高植物蛋白飲食結(jié)構(gòu)對雌性大鼠骨細(xì)胞的影響[J]. 云南醫(yī)藥, 2016,37(2):207-10.

[4] Liang J, Song W Q. Effects of high-fat and high plant protein diet on bone cells in female rats [J].MedPharmYunnan, 2016,37(2):207-10.

[5] 朱再勝, 戴 爽, 吳 玲, 等. 高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型中氧化應(yīng)激、炎癥遞質(zhì)對骨代謝的影響及其可能機(jī)制 [J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,44(9): 631-6.

[5] Zhu Z S, Dai S, Wu L, et al. The effects of inflammatory mediator and oxidative stress on bone metabolism in high fat diet-induced obesity mice and the underlying mechanism [J].JWenzhouMedUniv, 2014,44(9):631-6.

[6] Fujita Y, Maki K. High-fat diet-induced obesity triggers alveolar bone loss and spontaneous periodontal disease in growing mice [J].BMCObes, 2015,3: 1.

[7] 李淑惠, 梁燕龍, 楊亞軍,等. 丹參水溶性成分影響骨代謝的機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(7): 902-5.

[7] Li S H, Liang Y L, Yang Y J, et al. The research progress on the mechanism of bone metabolism affected by the water-soluble components of danshen [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(7): 902-5.

[8] 李 近, 楊亞軍, 劉鈺瑜. Foxos與骨質(zhì)疏松 [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(2):169 -71.

[8] Li J, Yang Y J, Liu Y Y, et al. Foxos and osteoporosis [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2): 169 -71.

[9] 王麗麗, 馬如風(fēng), 于 娜,等. 丹酚酸B通過抗氧化作用改善高脂飲食小鼠牙槽骨骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2017,23(3):281-5.

[9] Wang L L, Ma R F, Yu N, et al. Salvianolic acid B prevents mandibular osteoporosis through anti-oxidation in high fat diet exposed mice [J].ChinJOsteoporos, 2017,23(3):281-5.

[10] Bromme D, Panwar P, Turan S. Cathepsin K osteoporosis trials, pycnodysostosis and mouse deficiency models: commonalities and differences[J].ExpertOpinDrugDiscov, 2016,11(5):457-72.

[11] Goettsch C, Babelova A, Trummer O, et al. NADPH oxidase 4 limits bone mass by promoting osteoclastogenesis[J].JournalClinInvest, 2013,123(11):4731-8.

[12] Zhang S Q, Sun Y T, Xu T H, et al. Protective effect of metformin on renal injury of c57bl/6j mouse treated with high fat diet[J].DiePharmazie, 2014,69(12):904-8.

[13] Anvari E, Wikstrom P, Walum E, et al. The novel NADPH oxidase 4 inhibitor GLX351322 counteracts glucose intolerance in high-fat diet-treated C57BL/6 mice[J].FreeRadicRes, 2015,49(11):1308-18.

[14] Yi C, Hao K Y, Ma T, et al. Inhibition of cathepsin K promotes osseointegration of titanium implants in ovariectomised rats[J].SciRep, 2017,7: 44682.

[15] 王傳家, 王海魚, 許紅權(quán), 等. bFGF對豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成氨基葡聚糖的作用[J]. 中國美容醫(yī)學(xué), 2006,15(7):782-3.

[15] Wang C J, Wang H Y, Xu H Q, et al. Effects of bFGF on glycosaminoglycan of pig chondrocytes in culture [J].ChinJAestheticMed, 2006,15(7):782-3.